腺病毒介导的血管内皮生长因子联合干细胞生长因子治疗严重肢体缺血的实验研究

doi:10.3969/j.issn.1006-5725.2024.05.009

摘要/Abstract

摘要：

目的探究血管内皮生长因子（VEGF）和干细胞生长因子（HGF）双基因腺病毒载体在缺血组织中促血管生成的作用及疗效。方法将84只昆明小鼠随机分为假手术组、空白对照组、VEGF组、HGF组、VEGF+HGF组，构建左侧下肢缺血模型，血流仪观察缺血组织血运情况，Western blot及ELISA检测各组小鼠不同时间点VEGF、HGF表达，免疫组织化学染色检测缺血组织的血管生成情况（CD31、SMA），以小鼠治疗期间副作用评估安全性。结果建模成功后，各组小鼠左侧下肢血流流速均显著下降；术后第7天，各组小鼠左侧下肢血流流量均明显优于术后即刻（P < 0.05），且Ad-VEGF-HGF组小鼠左下肢血流量明显优于其他各组（P < 0.05）；术后28 d Ad-VEGF-HGF组小鼠左下肢血流量逐步稳定，且术后Ad-VEGF-HGF组小鼠血流明显优于其余各组，且VEGF组、HGF组均显著优于对照组（P < 0.05）；Western Blot及ELISA检测发现术后7、14、28 d时Ad-HGF组、Ad-VEGF组、Ad-VEGF-HGF组HGF蛋白、VEGF蛋白均明显高于对照组（P < 0.05），且14 d Ad-VEGF-HGF组的表达水平处于相对峰值（P < 0.001），术后第28天时表达水平逐步降低至术前水平。结论 Ad-VEGF-HGF基因注射可显著提高小鼠体内VEGF和HGF蛋白的表达水平并快速达到相对峰值水平，继而进一步促进下肢缺血后的血管生成，增加血流量，改善下肢循环。

关键词: 血管内皮生长因子, 干细胞生长因子, 下肢缺血, 腺病毒载体

Abstract:

Objective To explore the role and efficacy of VEGF and HGF gene adenovirus vector in promoting angiogenesis in ischemic tissue. Methods 84 Kunming mice were randomly divided into sham group， control group， VEGF group， HGF group and VEGF+HGF group， and the left lower limb ischemia model was established. The blood supply of ischemic tissue was observed by rheometer， and the expression levels of VEGF and HGF in each group were detected by Western Blot and ELISA. Immunohistochemical staining was used to detect angiogenesis （CD31， SMA） in ischemic tissues. Safety was assessed by side effects during treatment in mice. Results After the successful modeling， the blood flow velocity of the left lower limb in each group decreased significantly. On the 7th day after operation， the blood flow of the left lower limb in each group was significantly better than that on the 0th day after operation （P < 0.05）， and the blood flow of the left lower limb in Ad-VEGF-HGF group was significantly better than that in other groups （P < 0.05）. On the 28th day after operation， the blood flow of the left lower limb in Ad-VEGF-HGF group gradually stabilized， the blood flow in Ad-VEGF-HGF group was significantly better than that in other groups， and both VEGF group and HGF group were significantly better than the control group （P < 0.05）. On the 7th， 14th， and 28th days following surgery， HGF and VEGF protein levels in the Ad-HGF， Ad-VEGF， and Ad-VEGF-HGF groups were substantially greater than those in the control group （P < 0.05）. The expression level in the Ad-VEGF-HGF group peaked on the 14th day （all P < 0.001） and subsequently declined to preoperative levels on the 28th day after operation. Conclusion Ad-VEGF-HGF gene injection can effectively boost VEGF and HGF protein expression and rapidly reach the relative peak level， encouraging angiogenesis after lower limb ischemia， increasing blood flow， and improving lower limb circulation.

Key words: vascular endothelial growth factor, stem cell growth factor, lower limb ischemia, adenovirus vector

中图分类号:

R543.5

钟睿,王家宁,张蕾,郭凌郧,杨建业,郑飞,晏誉文,余丹丽,谭利国. 腺病毒介导的血管内皮生长因子联合干细胞生长因子治疗严重肢体缺血的实验研究[J]. 实用医学杂志, 2024, 40(5): 639-645.

Rui ZHONG,Jianing WANG,Lei ZHANG,Lingyun GUO,Jianye YANG,Fei ZHENG,Yuwen YAN,Danli YU,Liguo. TAN. Experimental study on treatment of severe limb ischemia with Ad⁃hVEGF⁃hHGF gene[J]. The Journal of Practical Medicine, 2024, 40(5): 639-645.

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参考文献 26

1	王书凡，赫玉香，程小龙，等. 杜鹃花总黄酮通过激活大鼠脑基底动脉血管内皮细胞TRPV4、Kca3.1和Kca2.3通道改善缺血性脑损伤［J］. 皖南医学院学报，2020，39（6）：516-520. doi:10.3969/j.issn.1002-0217.2020.06.002 doi: 10.3969/j.issn.1002-0217.2020.06.002
2	王爱红，石鸿雁，许樟荣. 基于临床症状和体征评估糖尿病足溃疡肢体缺血严重程度的价值［J］. 中华糖尿病杂志，2020，12（8）：585-588. doi:10.3760/cma.j.cn115791-20200506-00268 doi: 10.3760/cma.j.cn115791-20200506-00268
3	梁永红，冯超，梁顺添，等. 血管腔内介入治疗下肢严重缺血后急性肾损伤危险因素［J］. 中国介入影像与治疗学，2021，18（2）：91-94.
4	REIS P E， DE CARVALHO L P， YASUMURA E， et al. Impact of angiogenic therapy in the treatment of critical lower limb ischemia in an animal model［J］. Vasc Endovascular Surg， 2014，48（3）：207-216. doi:10.1177/1538574413518119 doi: 10.1177/1538574413518119
5	李志娟，庄百溪，马鲁波. 慢性威胁肢体性缺血中医药介入治疗研究进展［J］. 中西医结合心脑血管病杂志，2021，19（6）：956-958. doi:10.12102/j.issn.1672-1349.2021.06.016 doi: 10.12102/j.issn.1672-1349.2021.06.016
6	血管外科学会、欧洲血管外科学会和世界血管学会联盟全球血管指南编写小组. 慢性肢体威胁性缺血治疗的全球血管指南（全译）［J］. 中华血管外科杂志，2021，6（Z1）：1-108，F3.
7	杨川，郭发才，周栋. 重症下肢缺血治疗的研究进展［J］.重庆医学，2015，44（4）：544-547.
8	WATANABE M， NISHIKAWAJI Y， KAWAKAMI H， et al. Adenovirus biology，recombinant adenovirus，and adenovirus usage in gene therapy［J］.Viruses，2021，13（12）：2502. doi:10.3390/v13122502 doi: 10.3390/v13122502
9	SAKURAI F， TACHIBANA M， MIZUGUCHI H. Adenovirus vector-based vaccine for infectious diseases［J］. Drug Metab Pharmacokinet， 2022，42：100432. doi:10.1016/j.dmpk.2021.100432 doi: 10.1016/j.dmpk.2021.100432
10	杨宇，董继红，张荣荣，等. 年龄相关性黄斑变性患者抗VEGF治疗视力预后的影响因素研究［J］. 皖南医学院学报，2022，41（1）：36-39. doi:10.3969/j.issn.1002-0217.2022.01.010 doi: 10.3969/j.issn.1002-0217.2022.01.010
11	OZGUIR E， HEIDENREICH A， DAGTEKIN O， et al. Distribution of EphB4 and EphrinB2 in normal and malignant urogenitaltissue［J］. Urol Oncol，2011，29（ 1）：78-84. doi:10.1016/j.urolonc.2008.12.020 doi: 10.1016/j.urolonc.2008.12.020
12	VIJAYAKUMAR A， TIWARI R， KUMAR PRABHUSWAMY V.Throm-boangiitis obliterans （Buerger' s disease）-current practices［J］. Int J Inflam，2013，20（13）：1569.
13	SHIGEMATSU H， YASUDA K， IWAI T， et al. Randomized，double-blind， placebo-controlled clinical trial of hepato-cyte growth factor plasmid for critical limb ischemia［J］. Gene Ther，2010，17（9）：1152-1161. doi:10.1038/gt.2010.51 doi: 10.1038/gt.2010.51
14	MORISHITA R， MAKINO H， AOKI M，et al. Phase I/IIa clinicaltrial of therapeutic angiogenesis using hepatocyte growthfactor gene transfer to treat critical limb ischemia［J］. Arterioscler Throm Vas Biol， 2011，31（3）：713-720. doi:10.1161/atvbaha.110.219550 doi: 10.1161/atvbaha.110.219550
15	FARBER A， EBERHARDT R T. The current state of critical limb ischemia： a systematic review［J］. JAMA Surg， 2016， 151（11）： 1070-1077. doi:10.1001/jamasurg.2016.2018 doi: 10.1001/jamasurg.2016.2018
16	FARD B， DIJKSTRA P U， NEDA Study Group， et al. Mortality， reamputation， and preoperative comorbidities in patients undergoing dysvascular lower limb amputation［J］. Ann Vasc Surg， 2020， 64： 228-238. doi:10.1016/j.avsg.2019.09.010 doi: 10.1016/j.avsg.2019.09.010
17	FABIANI I， CALOGERO E， PUGLIESE N R， et al. Critical limb ischemia： a practical up-to-date review［J］. Angiology， 2018， 69（6）： 465-474. doi:10.1177/0003319717739387 doi: 10.1177/0003319717739387
18	HAGHIGHAT L， IONESCU C N， REGAN C J， et al. Review of the current basic science strategies to treat critical limb ischemia［J］. Vasc Endovascular Surg， 2019， 53（4）： 316-324. doi:10.1177/1538574419831489 doi: 10.1177/1538574419831489
19	郭平凡. 下肢慢性缺血性疾病的诊治［J］. 中国血管外科杂志（电子版），2021，13（4）：299-301，305.
20	JOHNSON T， ZHAO L， MANUEL G， et al. Approaches to therapeutic angiogenesis for ischemic heart disease［J］. J Mol Med， 2019， 97（2）： 141-151. doi:10.1007/s00109-018-1729-3 doi: 10.1007/s00109-018-1729-3
21	YLÄ-HERTTUALA S. Gene therapy of critical limb ischemia enters clinical use［J］. Mol Ther， 2019， 27（12）： 2053. doi:10.1016/j.ymthe.2019.11.001 doi: 10.1016/j.ymthe.2019.11.001
22	MÄKINEN K， MANNINEN H， HEDMAN M， et al. Increased vascularity detected by digital subtraction angiography after VEGF gene transfer to human lower limb artery： a randomized， placebo-controlled， double-blinded phase Ⅱ study［J］. Mol Ther， 2002， 6（1）： 127-133. doi:10.1006/mthe.2002.0638 doi: 10.1006/mthe.2002.0638
23	BARĆ P， ANTKIEWICZ M， ŚLIWA B， et al. Double VEGF/HGF gene therapy in critical limb ischemia complicated by diabetes mellitus［J］. J Cardiovasc Transl Res， 2021，14： 409-415. doi:10.1007/s12265-020-10066-9 doi: 10.1007/s12265-020-10066-9
24	李存娣，曹伟娅，王健. 血管内皮生长因子受体与肝细胞癌侵袭转移的关系［J］. 临床肝胆病杂志，2019，35（7）：1616-1620. doi:10.3969/j.issn.1001-5256.2019.07.042 doi: 10.3969/j.issn.1001-5256.2019.07.042
25	RIAUD M， HILAIRET G， SINDJI L， et al. Pharmacology active microcarriers delivering HGF associated with extracellular vesicles for myocardial repair［J］. Eur J Pharm Biopharm， 2021， 169： 268-279. doi:10.1016/j.ejpb.2021.10.018 doi: 10.1016/j.ejpb.2021.10.018
26	ROSENGART T K， LEE L Y， PATEL S R， et al.Angiogenesis Gene Therapy Phase IAssessment of Direct Intramyocardial Administration of an Adenovirus VectorExpressing VEGF12i cDNA to Individuals With Clinically Significant SevereCoronary Artery Disease［J］. Circulation， 1999，100：468-474. doi:10.1161/01.cir.100.5.468 doi: 10.1161/01.cir.100.5.468

时间	术前	术后即刻	术后第7天	术后第14天	术后第28天
空白对照组	1.03 ± 0.98^#	0.47 ± 0.40	0.67 ± 0.61^#	0.79 ± 0.74^#	0.82 ± 0.76^#
VEGF	1.05 ± 1.03^#	0.40 ± 0.36	0.69 ± 0.68^#	0.89 ± 0.85^#	0.89 ± 0.85^#
HGF	0.99 ± 0.97^#	0.36 ± 0.34	0.65 ± 0.63^#	0.85 ± 0.83^#	0.86 ± 0.82^#
VEGF+HGF	1.02 ± 0.98^#	0.42 ± 0.40	0.80 ± 0.77^#*△▲	0.99 ± 0.95^#*	0.97 ± 0.93^#*

指标	术前	术后第7天	术后第14天	术后第28天	F值	P值
VEGF	34.24 ± 1.05^#	36.99 ± 9.80^#	88.79 ± 23.22	23.98 ± 0.46^#	83.86	< 0.001
HGF	1.89 ± 0.80^#	5.19 ± 1.75^#	7.26 ± 0.38	4.20 ± 0.73^#	14.01	< 0.001

[1]	陈灿伟,廖壮文,范子文,黄帅,黄彦,陈斌伟. 溶酶体相关膜蛋白3通过VEGF/AKT通路抑制PC-3细胞增殖、转移及血管生成[J]. 实用医学杂志, 2024, 40(2): 182-187.
[2]	欧扬王逸之, 林斌武庞龙 . 从湿辨治抗血管内皮生长因子治疗后视网膜静脉阻塞黄斑水肿的疗效观察 [J]. 实用医学杂志, 2023, 39(6): 762-767.
[3]	陈耀鑫,黎松波,方冠军,叶国标,刘先银. 黄韧带中成纤维细胞生长因子1、血管内皮生长因子表达与腰椎管狭窄患者腰椎减压术后再狭窄的关系[J]. 实用医学杂志, 2023, 39(18): 2289-2293.
[4]	吴玉良吴春玲吴丹 . 血清sFLT1、CTRP3水平与子宫内膜异位症的相关性 [J]. 实用医学杂志, 2023, 39(14): 1798-1803.
[5]	蔡燕丽朱锦明张跃辉栾晓梅彭凤云李青杜长江 . 子痫前期孕妇外周血、胎盘组织中信号肽⁃CUB⁃ 表皮生长因子样结构域蛋白2的表达及意义[J]. 实用医学杂志, 2023, 39(12): 1518-1523.
[6]	黄建敏云艳芳杨桂新陈海燕蒋勇明黄东旭刘洁莫晓榕李雪斌. 生存素抑制剂YM155对脑梗死大鼠微血管密度及血管新生相关基因表达的影响 [J]. 实用医学杂志, 2022, 38(8): 946-951.
[7]	李继红牛梦琦 . 血管内皮生长因子水平对2型糖尿病患者并发视网膜微血管病变的预测价值 [J]. 实用医学杂志, 2022, 38(8): 1001-1005.
[8]	吕亚军任立中李军张海静张志坤 . 髓芯减压联合胶原基骨修复材料和血管内皮生长因子对兔股骨头坏死血管修复和微循环的影响 [J]. 实用医学杂志, 2022, 38(23): 2927-2932.
[9]	任志磊, 杨崇哲, 银孟卓, 黄凯华, 刘丰. 大鼠Kruppel样因子14腺病毒载体的构建及其对心肌细胞肥大的影响 [J]. 实用医学杂志, 2021, 37(4): 441-445.
[10]	夏旭, 崔洪泉, 胡培森, 王交托. 熟地黄多糖对前列腺癌PC⁃3细胞增殖凋亡的作用及对VEGF/Akt信号通路的影响 [J]. 实用医学杂志, 2021, 37(17): 2194-2198.
[11]	刘美莲苏法铭李晓玲彭晓霞陈晓铭. 血管内皮生长因子和促血管生成素2对甲状腺乳头状癌及颈部淋巴结转移的诊断价值 [J]. 实用医学杂志, 2021, 37(11): 1441-1444.