基于Wnt/β-catenin信号通路介导的自噬和凋亡探讨苦豆子碱对骨质疏松小鼠骨代谢的影响

doi:10.3969/j.issn.1006-5725.2025.04.006

摘要/Abstract

摘要：

目的本研究旨在探讨苦豆子碱（aloperine，ALO）通过Wnt/β-catenin信号通路介导的自噬和凋亡过程对骨质疏松（osteoporosis，OP）小鼠骨代谢的影响。方法将60只小鼠随机分成6组，每组10只：Sham组（假手术小鼠）、OP组（切除双侧卵巢建立骨质疏松症模型）、L-ALO组（OP小鼠腹腔注射10 mg/kg苦豆子碱）、M-ALO组（OP小鼠腹腔注射20 mg/kg苦豆子碱）、H-ALO组（OP小鼠腹腔注射30 mg/kg苦豆子碱）和EV组（OP小鼠灌胃0.09 mg/kg戊酸雌二醇），造模给药。检测小鼠胫骨的骨密度（BMD）与骨微结构。HE染色观察胫骨骨组织形态。ELISA检测小鼠血清中OCN、OPG、ALP、Ca和P的水平变化。免疫蛋白印迹检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、P62、Caspase-3、Caspase-9、Bax、Wnt3a、β-catenin和C-Myc蛋白表达水平。免疫荧光检测自噬小体。结果与Sham组相比，OP组的BMD和骨小梁厚度显著降低，骨小梁分离度和骨表面积与体积显著增加（P < 0.05）；OPG、OCN、Ca和P水平显著下调，ALP水平显著上调（P < 0.05）；LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1、Wnt3a、β-catenin和C-Myc蛋白表达水平显著降低，P62、Caspase-3、Caspase-9和Bax蛋白表达水平显著增加（P < 0.05）。与OP组相比，L-ALO组、M-ALO组和H-ALO组的BMD和骨小梁厚度显著增加，骨小梁分离度和骨表面积与体积显著降低（P < 0.05）；OPG、OCN、Ca和P水平显著上调，ALP水平显著下调（P < 0.05）；LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1、Wnt3a、β-catenin和C-Myc蛋白表达水平显著增加，P62、Caspase-3、Caspase-9和Bax蛋白表达水平显著降低（P < 0.05），并呈剂量依赖性。与OP组相比，EV组的BMD和骨小梁厚度显著增加，骨小梁分离度和骨表面积与体积比显著降低（P < 0.05）；OPG、OCN、Ca和P水平显著上调，ALP水平显著下调（P < 0.05）；LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1、Wnt3a、β-catenin和C-Myc蛋白表达水平显著增加，P62、Caspase-3、Caspase-9和Bax蛋白表达水平显著降低（P < 0.05）。结论苦豆子碱可能通过促进成骨细胞自噬，并抑制其凋亡来改善OP小鼠的骨代谢，其机制可能与Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。

关键词: 苦豆子碱, 骨质疏松, Wnt/β-catenin信号通路, 自噬, 凋亡

Abstract:

Objective To investigate the effects of aloperine （ALO） on bone metabolism in osteoporosis （OP） mice via Wnt/β?catenin signaling pathway?mediated autophagy and apoptosis. Methods Sixty mice were randomly allocated into six groups （n = 10 per group）： Sham group （sham?operated mice）， OP group （osteoporosis model induced by bilateral ovariectomy）， L?ALO group （OP mice intraperitoneally injected with 10 mg/kg aloperine）， M?ALO group （OP mice intraperitoneally injected with 20 mg/kg aloperine）， H?ALO group （OP mice intraperitoneally injected with 30 mg/kg aloperine）， and EV group （OP mice administered 0.09 mg/kg estradiol valerate）. Bone mineral density and microstructure of the tibia were assessed. Hematoxylin and eosin （HE） staining was performed to examine the morphology of tibial bone tissue. Serum levels of OCN， OPG， ALP， Ca， and P were measured using ELISA. Protein expression levels of LC3-Ⅱ， LC3-Ⅰ， Beclin?1， P62， Caspase?3， Caspase?9， Bax， Wnt3a， β?catenin， and C?Myc were analyzed by Western blot. Autophagosomes were visualized using immunofluorescence. Results Compared with the Sham group， the bone mineral density （BMD） and trabecular thickness in the OP group were significantly reduced， while trabecular separation， bone surface area， and volume were significantly increased （P < 0.05）. The levels of OPG， OCN， Ca， and P were significantly downregulated， whereas ALP levels were significantly upregulated （P < 0.05）. Additionally， the LC3?Ⅱ/LC3?Ⅰ ratio and expression levels of Beclin?1， Wnt3a， β?catenin， and C?Myc proteins were significantly decreased， while the expression levels of P62， Caspase?3， Caspase?9， and Bax proteins were significantly increased （P < 0.05）. Compared with the OP group， the L?ALO， M?ALO， and H?ALO groups exhibited significant increases in BMD and trabecular thickness， along with significant decreases in trabecular separation， bone surface area， and volume （P < 0.05）. The levels of OPG， OCN， Ca， and P were significantly upregulated， while ALP levels were significantly downregulated （P < 0.05）. Furthermore， the LC3?Ⅱ/LC3?Ⅰ ratio and expression levels of Beclin?1， Wnt3a， β?catenin， and C?Myc proteins were significantly increased， while the expression levels of P62， Caspase?3， Caspase?9， and Bax proteins were significantly decreased （P < 0.05）. In contrast， compared with the OP group， the EV group showed significant increases in BMD and trabecular thickness， as well as significant decreases in trabecular separation， bone surface area to volume ratio （P < 0.05）. The levels of OPG， OCN， Ca， and P were significantly upregulated， while ALP levels were significantly downregulated （P < 0.05）. Moreover， the LC3?Ⅱ/LC3?Ⅰ ratio and expression levels of Beclin?1， Wnt3a， β?catenin， and C?Myc proteins were significantly increased， while the expression levels of P62， Caspase?3， Caspase?9， and Bax proteins were significantly decreased （P < 0.05）. Conclusions Peanine may promote autophagy in osteoblasts and inhibit their apoptosis， thereby improving bone metabolism in OP mice. This effect may be mediated through the activation of the Wnt/β?catenin signaling pathway.

Key words: aloperine, osteoporosis, Wnt/β-catenin signaling pathway, autophagy, apoptosis

中图分类号:

R285.5

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组别	BMD/（g/cm²）	骨小梁厚度/μm	骨小梁分离度/（pg/mL）	骨表面积与体积比/（1/mm）
Sham组	0.46 ± 0.05	140.55 ± 14.94	322.33 ± 61.57	22.98 ± 3.26
OP组	0.22 ± 0.03^?	93.23 ± 13.61^?	869.52 ± 89.29^?	38.52 ± 3.34^?
L-ALO组	0.28 ± 0.04^#	106.97 ± 13.53^#	842.14 ± 86.99^#	32.91 ± 3.07^#
M-ALO组	0.37 ± 0.05^#△	120.26 ± 12.87^#△	637.16 ± 73.85^#△	28.28 ± 3.11^#△
H-ALO组	0.44 ± 0.04^#▽	132.48 ± 12.01^#▽	416.97 ± 71.55^#▽	23.46 ± 3.03^#▽
EV组	0.38 ± 0.03^#	123.42 ± 14.04^#	716.28 ± 70.85^#	27.16 ± 3.24^#
F值	975.960	951.862	914.697	982.343
P值	< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001

组别	OPG/（ng/L）	OCN/（ng/L）	ALP/（U/L）	Ca/（mmol/L）	P/（mmol/L）
Sham组	11.87 ± 1.33	17.24 ± 1.67	41.68 ± 5.27	2.64 ± 0.31	2.89 ± 0.39
OP组	4.23 ± 0.71^?	7.28 ± 1.18^?	86.94 ± 8.97^?	1.13 ± 0.16^?	1.09 ± 0.16
L-ALO组	6.87 ± 1.31^#	9.57 ± 1.21^#	71.16 ± 8.12	1.61 ± 0.22^#	1.47 ± 0.22
M-ALO组	8.94 ± 1.09^#△	13.59 ± 1.71^#△	60.01 ± 7.69^#△	1.99 ± 0.16^#△	2.15 ± 0.35
H-ALO组	10.96 ± 1.48^#▽	16.99 ± 1.87^#▽	43.67 ± 8.02^#▽	2.59 ± 0.29^#▽	2.87 ± 0.38
EV组	9.46 ± 1.22^#	14.23 ± 1.56^#	61.59 ± 8.15^#	2.16 ± 0.21^#	2.22 ± 0.33
F值	671.441	924.945	779.936	969.647	587.916
P值	< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001

组别	LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ	Beclin-1	P62
Sham组	1.03 ± 0.13	1.06 ± 0.14	0.41 ± 0.06
OP组	0.29 ± 0.03^?	0.33 ± 0.05^?	1.39 ± 0.16^?
L-ALO组	0.41 ± 0.06^#	0.49 ± 0.06^#	1.12 ± 0.15^#
M-ALO组	0.72 ± 0.09^#△	0.77 ± 0.09^#△	0.79 ± 0.10^#△
H-ALO组	1.01 ± 0.11^#▽	1.02 ± 0.15^#▽	0.45 ± 0.06^#▽
EV组	0.69 ± 0.07^#	0.76 ± 0.10^#	0.71 ± 0.09^#
F值	858.761	666.697	765.989
P值	< 0.001	< 0.001	< 0.001

组别	Caspase-3	Caspase-9	Bax
Sham组	0.31 ± 0.05	0.19 ± 0.03	0.23 ± 0.04
OP组	1.23 ± 0.14^*	1.16 ± 0.15^*	1.29 ± 0.17^*
L-ALO组	0.98 ± 0.10^#	0.92 ± 0.09^#	0.92 ± 0.11^#
M-ALO组	0.69 ± 0.08^#△	0.71 ± 0.05^#△	0.66 ± 0.07^#△
H-ALO组	0.34 ± 0.05^#▽	0.23 ± 0.03^#▽	0.29 ± 0.04^#▽
EV组	0.67 ± 0.09^#	0.51 ± 0.08^#	0.61 ± 0.09^#
F值	882.281	879.487	716.943
P值	< 0.001	< 0.001	< 0.001

组别	Wnt3a	β-catenin	C-Myc
Sham组	1.03 ± 0.10	1.05 ± 0.11	1.12 ± 0.16
OP组	0.23 ± 0.04^?	0.29 ± 0.05^?	0.34 ± 0.05^?
L-ALO组	0.45 ± 0.06^#	0.49 ± 0.06^#	0.52 ± 0.07^#
M-ALO组	0.75 ± 0.09^#△	0.77 ± 0.09^#△	0.81 ± 0.10^#△
H-ALO组	0.98 ± 0.10^#▽	1.01 ± 0.13^#▽	1.08 ± 0.16^#▽
EV组	0.78 ± 0.10^#	0.79 ± 0.11^#	0.82 ± 0.11^#
F值	955.455	795.038	614.914
P值	< 0.001	< 0.001	< 0.001