基于TLR4-NF-κB信号通路的槐果碱改善人支气管上皮细胞炎症和黏液高分泌的机制

doi:10.3969/j.issn.1006-5725.2023.19.009

摘要/Abstract

摘要：

目的基于TLR4-NF-κB信号通路探讨槐果碱（SC）体外抗炎作用及其抗哮喘的潜在效应机制。方法采用脂多糖（LPS）刺激人支气管上皮细胞NCI-H292诱导体外炎症模型，给予不同浓度SC进行治疗。采用MTT法筛选LPS和SC对NCI-H292细胞的安全浓度；设Control组、LPS组（10 μg/mL LPS）、SC组（10 μg/mL LPS+不同浓度SC），ELISA法检测细胞中黏蛋白5AC（MUC5AC）的表达和上清液中白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-8（IL-8）的分泌情况；RT-PCR法检测细胞中MUC5AC、IL-6、IL-8、髓样分化因子（MyD88）和核因子-κB（NF-κB p65）mRNA的表达；Western blot方法检测细胞中Toll样受体4（TLR4）、肿瘤坏死因子受体相关蛋白6（TRAF6）、磷酸化p38（p-p38）和磷酸化p65（p-p65）以及细胞核内NF-κB p65的蛋白表达。结果 MTT结果显示，LPS和SC分别在0 ~ 10 μg/mL、0 ~ 40 μg/mL浓度范围内对细胞活力无影响；ELISA结果表明，与Control组相比，LPS组细胞中MUC5AC含量极显著升高（P < 0.01），细胞上清液中IL-6、IL-8也极显著升高（P < 0.01）；与LPS组相比，SC组细胞中MUC5AC含量极显著降低（P < 0.01），细胞上清液中IL-6、IL-8也极显著降低（P < 0.01）；RT-PCR结果显示，与Control组相比，LPS组细胞中MUC5AC、IL-6、IL-8、MyD88和NF-κB p65 mRNA表达均极显著升高（P < 0.01），而SC组细胞中MUC5AC、IL-6、IL-8 mRNA的表达显著降低（P < 0.05），MyD88和NF-κB p65 mRNA的表达极显著降低（P < 0.01）。Western blotting结果表明，SC可极显著降低LPS诱导的NCI-H292细胞中TRAF6、TLR4、p-p38和p-p65以及细胞核内NF-κB p65蛋白表达（P < 0.01）。结论 SC可能通过抑制TLR4-NF-κB信号通路，改善气道炎症和黏液高分泌，进而发挥抗哮喘的作用。

关键词: 槐果碱, NCI-H292细胞, TLR4-NF-κB信号通路, 炎症, 黏液高分泌

Abstract:

Objective To investigate the anti-inflammatory effect of sophocarpine （SC） in vitro and the potential mechanism of its anti-asthma effect based on the TLR4-NF-κB signaling pathway. Methods NCI-H292 cells were stimulated by Lipopolysaccharide （LPS） to induce inflammation model in vitro， and SC was given in different concentrations. The safe concentrations of LPS and SC on NCI-H292 cells were screened by MTT method， and the control group， LPS group （10 μg/mL LPS） and SC group （10 μg/mL LPS+ different concentrations of SC） were set up. The expression of mucin 5AC （MUC5AC） in cells and the secretion of Interleukin-6（IL-6） and Interleukin-8（IL-8） in the supernatant were detected by ELISA. The mRNA expression of MUC5AC， IL-6， IL-8， myeloid differentiation factor 88（MyD88） and nuclear factor-kappa B p65（NF-κB p65） in cells was detected by RT-PCR. The protein expression of TLR4， tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 （TRAF6）， p-p38 and p-p65 in cells and NF-κB p65 in nucleus was detected by Western blotting. Results MTT results showed that LPS and SC had no effect on cell viability in the concentration range of 0 ~ 10 μg/mL and 0 ~ 40 μg/mL. The results of ELISA showed that the content of MUC5AC in LPS group was significantly higher than that in control group （P < 0.01）， and the levels of IL-6 and IL-8 in the supernatant of cells were also extremely significant increase （P < 0.01）. Compared with the model group， the content of MUC5AC in SC group extremely significant reduction （P < 0.01）， and the content of IL-6 and IL-8 in cell supernatant also significantly reduced （P < 0.01）. RT-PCR results showed that the expressions of MUC5AC， IL-6， IL-8， MyD88 and NF-κB p65 mRNA in LPS group were extremely significant higher than those in control group （P < 0.01）， however， the expression of MUC5AC， IL-6 and IL-8 mRNA in SC group decreased significantly （P < 0.05）， and the expression of MyD88 and NF-κB p65 mRNA extremely significant reduction （P < 0.01）. Western blotting results showed that SC could extremely significant reduction the expression of TRAF6， TLR4， p-p38 and p-p65 in NCI-H292 cells induced by LPS and the expression of NF-κB p65 protein in nucleus （P < 0.01）. Conclusion SC may play an anti-asthmatic role by inhibiting TLR4-NF-κB signaling pathway， improving airway inflammation and mucous hypersecretion.

Key words: sophocarpine, NCI-H292 cells, TLR4-NF-κB signal pathway, inflammation, mucus hypersecretion

中图分类号:

R285.5

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图/表 6

表1

图1

图2

图3

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图5

参考文献 28

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基因	引物序列
GAPDH	F 5′-TGTTCGTCATGGGTGTGAACC-3′
GAPDH	R 5′-CATGAGTCCTTCCACGATACC-3′
MUC5AC	F 5′-TCCACCATATACCGCCACAGA-3′
MUC5AC	R 5′-TGGACGGACAGTCACTGTCAAC-3′
IL-6	F 5′-GACAGCCACTCACCTCTTCA-3′
IL-6	R 5′-AGTGCCTCTTTGCTGCTTTC-3′
IL-8	F 5′-AAACCACCGGAAGGAACCAT-3′
IL-8	R 5′-GCCAGCTTGGAAGTCATGT-3′
MyD88	F 5′-GATGGTAGCGGTTGTCTCTGAT-3′
MyD88	R 5′-GATGCTGGGGAACTCTTTCTTC-3′
NF-κB p65	F 5′-AGTACCCTGAGGCTATAACTCGC-3′
NF-κB p65	R 5′-TCCGCAATGGAGGAGAAGTC-3′

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