荧光PCR探针熔解曲线技术检测痰标本中结核分枝杆菌异烟肼耐药性的研究

doi:10.3969/j.issn.1006-5725.2023.20.019

摘要/Abstract

摘要：

目的评价荧光PCR探针熔解曲线（fluorescence polymerase chain reaction probe melting curve， MeltPro）技术检测痰标本结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis， MTB）异烟肼耐药性的应用价值。方法收集2021年5月至2022年5月在北京市疾病预防控制中心结核病门诊GeneXpert MTB/RIF检测为MTB的（简称MTB阳性）患者痰标本，对每份标本同时进行涂片镜检、分枝杆菌分离培养、MeltPro技术和线性探针技术（GenoType MTBDRplus，简称Hain试验）异烟肼耐药检测。分析MeltPro技术检测痰标本MTB异烟肼的耐药性，痰标本荷菌量对检测结果的影响；以培养阳性菌株异烟肼比例法药敏结果为参考标准，评价MeltPro技术耐药检测效能。结果收集MTB阳性的合格痰标本157例，经分枝杆菌分离培养获得阳性菌株130株。MeltPro技术痰标本MTB异烟肼耐药性检测成功率为84.1%（132/157）。不同痰涂片结果等级间，MeltPro技术检测异烟肼耐药成功的比例差异存在有统计学意义（H = 24.169，P = 0.000），随痰涂片结果等级的升高，检测成功率由“阴性”标本的64.8%（35/54）升高到“3+”“4+”标本的100%（17/17，6/6）；该比例也随GeneXpert MTB/RIF检测MTB等级的升高而升高，由“极低”标本的54.8%（17/31），到“高”标本的96.4%（27/28），各等级间差异有统计学意义（H = 27.763，P = 0.000）。MeltPro技术、Hain试验和药敏试验的异烟肼耐药检出率分别为22.0%（29/132），15.3%（19/124），和14.6%（19/130），三者差异无统计学意义（χ² = 2.997，P = 0.223）。以培养阳性菌株比例法药敏试验结果为参考标准，MeltPro技术检测异烟肼耐药的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为：84.6%（11/13）、91.2%（93/102）、55%（11/20）、97.9%（93/95），Kappa值为0.614；Hain试验检测异烟肼耐药的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为： 55.6%（10/18）、92.3%（84/91）、58.8%（10/17）、91.3%（84/92），Kappa值为0.490。结论 MeltPro技术可直接检测痰标本MTB耐药性，快速准确筛查患者耐药情况，缩短耐药筛查时间。

关键词: 分枝杆菌，结核, 荧光PCR探针熔解曲线, 耐药性检测, 痰

Abstract:

Objective To evaluate the application value of the fluorescence PCR probe melting curve（MeltPro） technique in the detection of isoniazid drug- resistance of Mycobacterium tuberculosis （MTB） in sputum samples. Methods In this study， we collected sputum samples of PTB that were identified as MTB by GeneXpert MTB/RIF method（MTB positive） from 2021 to 2022. These sputum samples were detected including smear， Mycobacterium culture， GenoType MTBDRplus，and isoniazid drug?resistance test by MeltPro technique. We did the proportional drug sensitivity test （DST） of isoniazid for culturing positive strains， analyzed the influence of the amount of bacteria in sputum samples on the results of MeltPro technique， compared the difference in the detection rate of isoniazid resistance by proportional DST， GenoType MTBDRplus， and MeltPro technique； The proportional DST results of isoniazid were used as a standard to evaluate the isoniazid drug?resistance detection efficiency of MeltPro technique and GenoType MTBDRplus. Results 157 qualified MTB positive sputum samples were collected， after Mycobacterium culture， we got 130 strains. The rate of success for isoniazid in sputum samples detected by MeltPro technique was84.1%（132/157）. Among different grades of sputum smear results， there is a difference in the successful rate of MeltPro technique （H = 24.169，P = 0.000）， increased with the grade of sputum smear results， the successful rate was increased from64.8% （32/54，the negative sputum）to 100.0%（17/17、6/6，the positive sputum grade 3+、4+）； the successful rate also increased with the increase of MTB grade detected by GeneXpert MTB/RIF， from54.8%（17/31，the very low sputum） to 96.4%（27/28，the high sputum）and the difference between each grade was statistically significant （H = 27.763，P = 0.000）. The detection rate of isoniazid resistance using MeltPro technique， GenoType MTBDRplus and proportional DST were 22.0%（29/132），15.3%（19/124），和14.6%（19/130）， respectively. There was no statistically significant difference between the three methods （χ² = 2.997，P = 0.223）. Based on the results of proportional DST， the sensitivity， specificity， positive predictive value and negative predictive value of MeltPro technique in the detection of isoniazid were 84.6%（11/13）、91.2%（93/102）、55%（11/20）、97.9%（93/95）， respectively， Kappa is 0.614. The sensitivity， specificity， positive predictive value and negative predictive value of GenoType MTBDRplus in the detection of isoniazid were 55.6%（10/18）、92.3%（84/91）， 58.8%（10/17）， 91.3%（84/92），respectively， Kappa is 0.490. Conclusion The MeltPro technique has high sensitivity and specificity in detecting MTB isoniazid resistance in sputum samples of pulmonary tuberculosis patients， and can quickly and accurately screen for isoniazid resistance in patients； To improve the success rate of testing， it is necessary to pay attention to the selection of sputum samples when promoting the application in grassroots laboratories.

Key words: Mycobacterium tuberculosis, fluorescence PCR probe melting curve, drug resistance, phlegm

中图分类号:

R521

王嫩寒,赵琰枫,田丽丽,陈双双,陈昊,任怡宣,李传友,代小伟. 荧光PCR探针熔解曲线技术检测痰标本中结核分枝杆菌异烟肼耐药性的研究[J]. 实用医学杂志, 2023, 39(20): 2664-2670.

Nenhan WANG,Yanfeng ZHAO,Lili TIAN,Shuangshuang CHEN,Hao CHEN,Yixuan REN,Chuanyou LI,Xiaowei. DAI. Clinical application of fluorescence polymerase chain reaction probe melting curve technique in detecting isoniazid drug⁃resistance of Mycobacterium tuberculosis in sputum samples[J]. The Journal of Practical Medicine, 2023, 39(20): 2664-2670.

图/表 5

图1

表1

表2

表3

表4

参考文献 21

1	中国防痨协会. 耐药结核病化学治疗指南（2019年简版）. 中国防痨杂志， 2019， 41（10）： 1025-1073.
2	SWAIN S S， PAIDESETTY S K， PADHY R N， et al. Isoniazid-phytochemical conjugation： A new approach for potent and less toxic anti-TB drug development［J］. Chem Biol Drug Des， 2020，96（2）：714-730.
3	ZHAO X， YU H， YU S， et al. Hydrogen peroxide-mediated isoniazid activation catalyzed by Mycobacterium tuberculosis catalase-peroxidase （KatG） and its S315T mutant［J］. Biochemistry， 2006，45（13）：4131-4140.
4	QIN L， HUANG C H， XU D， et al. Molecular mechanism for the activation of the anti-tuberculosis drug isoniazid by Mn（III）： First detection and unequivocal identification of the critical N-centered isoniazidyl radical and its exact location［J］. Free Radic Biol Med， 2019，143：232-239.
5	World Health Organization. WHO treatment guidelines for isoniazid-resistant tuberculosis： supplement to the WHO treatment guidelines for drug-resistant tuberculosis. （2018）
6	World Health Organization. Global tuberculosis report 2020. Geneva：World Health Organization， 2021.
7	SULIS G， PAI M. Isoniazid-resistant tuberculosis： A problem we can no longer ignore［J］. PLoS Med， 2020，17（1）：e1003023.
8	赵雁林，逄宇. 结核病实验室检验规程［M］. 北京：人民卫生出版社， 2015.
9	World Health Organization. Global tuberculosis report 2020. Geneva：World Health Organization， 2021.
10	WHO Expert Group Report Molecular line probe assay more rapid screening of patients at risk of multidrug-resistant tuberculosis（MDR-TB）［R］. Geneva： World Health Organization， 2008.
11	赵国连，崔晓利，康磊，等. 荧光PCR探针熔解曲线技术检测涂阳患者痰标本中结核分枝杆菌耐药性的价值［J］. 中国防痨杂志， 2019，41（2）：149-155.
12	HUO F， MA Y， LIU R，et al. Interpretation of Discordant Rifampicin Susceptibility Test Results Obtained Using GeneXpert vs Phenotypic Drug Susceptibility Testing［J］. Open Forum Infect Dis， 2020，7（8）：ofaa279.
13	谢芳晖，梁丽，赵霞，等. 肺结核患者痰标本采集的研究进展［J］. 中国防痨杂志， 2022，44（9）：978-982.
14	刘春平，熊德芳，谭耀驹. 两种分子检测技术对结核分枝杆菌临床分离株耐药性诊断价值的评价［J］. 临床肺科杂志， 2021，26（6）：815-819.
15	田丽，周伟，黄星，等. 中国异烟肼耐药结核分枝杆菌基因突变特征分析［J］. 中国防痨杂志， 2022，44（4）：354-361.
16	KHAN A S， PHELAN J E， KHAN M T， et al. Genetic mutations underlying isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis in Khyber Pakhtunkhwa， Pakistan［J］. Tuberculosis （Edinb）， 2023，138：102286.
17	CHEN Y， TAKIFF H E， GAO Q. Phenotypic instability of Mycobacterium tuberculosis strains harbouring clinically prevalent drug-resistant mutations［J］. Lancet Microbe， 2023，4（5）：e292.
18	CLSI. Performance standards for susceptibility testing of Mycobacteria， Nocardia spp，and Other Aerobic Actinomycetes［R］. Wayne： Clinical and Laboratory Standards Institute， 2023.
19	《中国防痨杂志》编辑委员会，中国医疗保健国际交流促进会结核病防治分会基础学组和临床学组. 结核分枝杆菌耐药性检测专家共识［J］. 中国防痨杂志， 2019，41（2）：129-137.
20	ZHANG Z， WANG Y， PANG Y，. et al. Comparison of different drug susceptibility test methods to detect rifampin heteroresistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother， 2014，58（9）：5632-5635.
21	龚兰，牛群，王楠，等. 结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变与其他抗结核药物耐药的相关性［J］. 实用医学杂志， 2023， 39（11）： 1353-1358.

痰涂片结果	总数	MeltPro技术异烟肼耐药检测成功
阴性	54	35（64.8）
1-8条/300视野	19	17（89.5）
1+	29	26（89.7）
2+	32	31（96.9）
3+	17	17（100）
4+	6	6（100）
合计	157	132（84.1）
H值		24.169
P值		0.000

GeneXpert MTB/RIF 检测MTB结果	总数	MeltPro技术异烟肼耐药检测成功
极低	31	17（54.8）
低	50	42（84.0）
中	48	46（95.8）
高	28	27（96.4）
合计	157	132（84.1）
H值		27.763
P值		0.000

检测方法		比例法药敏		敏感度［%（95%CI）］	特异度［%（95%CI）］	阳性预测值［%（95%CI）］	阴性预测值［%（95%CI）］	Kappa值（95%CI）
检测方法		耐药	敏感	敏感度［%（95%CI）］	特异度［%（95%CI）］	阳性预测值［%（95%CI）］	阴性预测值［%（95%CI）］	Kappa值（95%CI）
MeltPro技术	耐药	11	9	84.6（53.7 ~ 97.3	91.2（84.1 ~ 95.2）	55（32.1 ~ 76.2）	97.9（91.9 ~ 99.6）	0.614（41.0 ~ 81.8）
MeltPro技术	敏感	2	93	84.6（53.7 ~ 97.3	91.2（84.1 ~ 95.2）	55（32.1 ~ 76.2）	97.9（91.9 ~ 99.6）	0.614（41.0 ~ 81.8）
Hain 试验	耐药	10	7	55.6（31.4 ~ 77.7）	92.3（84.3 ~ 96.6）	58.8（33.5 ~ 80.1）	91.3（83.1 ~ 95.9）	0.490（26.7 ~ 71.3）
Hain 试验	敏感	8	84	55.6（31.4 ~ 77.7）	92.3（84.3 ~ 96.6）	58.8（33.5 ~ 80.1）	91.3（83.1 ~ 95.9）	0.490（26.7 ~ 71.3）

样本号	MeltPro技术	Hain 试验	药敏试验
1	katG315	katG315	/
2	katG315	未检出	敏感
3	ahpC启动子区（-40--30）及（-15-3）位点，inhA-17--8位点	inhA-15	耐药
4	inhA-17--8位点	inhA-15	敏感
5	inhA-17--8位点	inhA-15	敏感
6	inhA-17--8位点	未检出	/
7	ahpC启动子区（-40--30）及（-15-3）位点	无突变	敏感
8	ahpC启动子区（-40--30）及（-15-3）位点	无突变	/
9	katG缺失	未检出	敏感
10	katG315，inhA-17--8位点	无突变	敏感
11	inhA-17--8位点	无突变	敏感
12	inhA-17--8位点	未检出	/
13	ahpC启动子区（-40--30）及（-15-3）位点	无突变	敏感
14	katG315	katG315	耐药
15	katG315	katG315	耐药
16	katG315	katG315	耐药
17	ahpC启动子区（-40--30）及（-15-3）位点	inhA-15、katG315	/
18	inhA-17--8位点	inhA-15	敏感
19	katG315	katG315	耐药
20	inhA启动子-17--8位点katG315	inhA-15、katG315	耐药
21	inhA-17--8位点	inhA-15	敏感
22	katG315	katG315	耐药
23	inhA-17--8位点	inhA-15	耐药
24	inhA-17--8位点	inhA-15	耐药
25	inhA-17--8位点	inhA-15	敏感
26	inhA-17--8位点	inhA-8	/
27	katG315	无突变	敏感
28	katG315	katG315	耐药
29	katG315	katG315	耐药

[1]	王胜芬赵雁林 . 升级结核病防治策略，提高结核病患者发现水平 [J]. 实用医学杂志, 2023, 39(11): 1331-1334.
[2]	谢磊梁雅雪熊延军王华. 耐多药肺结核患者3个月末痰菌阴转影响因素分析 [J]. 实用医学杂志, 2022, 38(6): 701-706.
[3]	董文雅魏文静谭卫国张晨晨徐华丽余美玲江振友周琳, 陈亮. 常规抗结核化疗对肺结核患者痰液菌群的影响 [J]. 实用医学杂志, 2021, 37(3): 336-342.
[4]	谭燕彭玉兰张云辉王盛兰. 慢性阻塞性肺疾病急性加重期住院患者痰细胞学和预后的相关性[J]. 实用医学杂志, 2021, 37(23): 3014-3019.
[5]	陈少旭, 梁小银, 侯晓亮. 山楂消脂胶囊对高血压并颈动脉硬化患者的临床作用 [J]. 实用医学杂志, 2021, 37(14): 1892-1896.