LncRNA GNAS-AS1通过调节miR-449a/Notch1轴参与胃癌细胞的增殖和迁移

doi:10.3969/j.issn.1006-5725.2024.04.008

摘要/Abstract

摘要：

目的探究长链非编码RNA（LncRNA）GNAS反义RNA1（GNAS-AS1）通过调节miR-449a/缺刻基因1（Notch1）轴对胃癌（GC）细胞增殖和迁移的影响。方法收集四川省人民医院2013年9月至2017年9月30例确诊为GC的患者肿瘤组织与癌旁组织标本；将GC细胞AGS随机分为对照组（Control组）、si-NC组、si-GNAS-AS1组、si-GNAS-AS1+inhibitor NC组、si-GNAS-AS1+miR-449a inhibitor组。实时荧光定量PCR检测GNAS-AS1、miR-449a和Notch1 mRNA的表达；MTT实验、平板克隆形成实验检测增殖；wound healing实验检测细胞迁移；Transwell实验检测细胞侵袭。Western Blot检测Notch1、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin蛋白表达。双荧光素酶报告基因实验验证miR-449a和GNAS-AS1、Notch1的关系。结果与癌旁组织相比，肿瘤组织中GNAS-AS1、Notch1 mRNA表达升高，miR-449a表达降低（P < 0.05）。与Control组、si-NC组相比，si-GNAS-AS1组AGS细胞GNAS-AS1表达、OD₄₉₀值、克隆形成数、划痕愈合率、细胞侵袭数目、Notch1、Vimentin、N-cadherin蛋白表达表达降低，miR-449a表达、E-cadherin蛋白表达升高（P < 0.05）。与si-GNAS-AS1组、si-GNAS-AS1+inhibitor NC组相比，si-GNAS-AS1+miR-449a inhibitor组OD₄₉₀值、划痕愈合率、细胞侵袭数目、Notch1、Vimentin、N-cadherin表达升高（P < 0.05），miR-449a表达、E-cadherin蛋白表达降低（P < 0.05）。GNAS-AS1靶向负调控miR-449a表达，miR-449a靶向负调控Notch1表达。结论沉默GNAS-AS1可能通过上调miR-449a来抑制Notch1蛋白的表达，从而抑制GC细胞增殖、迁移、侵袭过程。

关键词: 长链非编码RNA GNAS反义RNA1, miR-449a, 缺刻基因1, 胃癌, 迁移, 增殖

Abstract:

Objective To explore the impacts of long non-coding RNA （LncRNA） GNAS antisense RNA1 （GNAS-AS1） on the proliferation and migration of gastric cancer （GC） cells by regulating the miR-449a/Notch1 axis. Method Tumor tissue and adjacent tissue samples were collected from 30 patients diagnosed with GC at Sichuan Provincial People's Hospital from September 2013 to September 2017； GC cells AGS were randomly divided into Control group， si-NC group， si-GNAS-AS1 group， si-GNAS-AS1+inhibitor NC group， and si-GNAS-AS1+miR-449a inhibitor group. Real-time fluorescence quantitative PCR method was applied to detect the expression of GNAS-AS1， miR-449a， and Notch1 mRNA； MTT experiments and plate cloning experiments were applied to detect the proliferation； wound healing test was applied to detect cell migration； Transwell experiment was applied to detect cell invasion. Western Blot was applied to detect the expression of Notch1， E-cadherin， Vimentin， and N-cadherin proteins. Double Luciferase reporter gene experiment was applied to verify the relationship between GNAS-AS1 and miR-449a， between miR-449a and Notch1， respectively. Results Compared with adjacent tissues， the expression of GNAS-AS1 and Notch1 mRNA in tumor tissue was increased， the expression of miR-449a was reduced （P < 0.05）. Compared with the Control group and si-NC group， the expression of GNAS-AS1， OD₄₉₀ value， number of clones formed， scratch healing rate， number of cell invasions， and the expression of Notch1， Vimentin， and N-cadherin proteins in AGS cells in the si-GNAS-AS1 group reduced， the expression of miR-449a and E-cadherin protein increased （P < 0.05）. Compared with the si-GNAS-AS1 group and the si-GNAS-AS1+inhibitor NC group， the OD₄₉₀ value， scratch healing rate， number of cell invasions， Notch1， Vimentin， and N-cadherin expression in the si-GNAS-AS1+miR-449a inhibitor group increased， the expression of miR-449a and E-cadherin protein reduced （P < 0.05）. GNAS-AS1 targeted and negatively regulated miR-449a expression， while miR-449a targeted and negatively regulated Notch1 expression. Conclusion Silencing GNAS-AS1 may inhibit the expression of Notch1 protein by up-regulating miR-449a， thereby inhibiting the proliferation， migration， and invasion processes of GC cells.

Key words: long non-coding RNA GNAS antisense RNA1, miR-449a, Notch1, gastric cancer, migration, proliferation

中图分类号:

R735.2

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图/表 13

表1

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参考文献 18

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基因名称	引物序列（5′→3′）
GNAS-AS1	上游：GACGCCTTTCCTACGG
GNAS-AS1	下游：TGGTAACGCACCTTCG
miR-449a	上游：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG
miR-449a	下游：AACACGCTGGCAGTGTATTG
Notch1	上游：AGGTGCAGCCACAGAACTTA
Notch1	下游：TCGGACCAATCAGAGATGTT
U6	上游：GCTTCGGCAGCACATA
U6	下游：ATGGAACGCTTCACGA
GAPDH	上游：GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT
GAPDH	下游：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG

组别	GNAS-AS1	miR-449a	Notch1
癌旁组织	1.00 ± 0.00	1.00 ± 0.00	1.00 ± 0.00
肿瘤组织	2.58 ± 0.28^*	0.41 ± 0.05^*	2.17 ± 0.24^*

组别	GNAS-AS1	miR-449a	Notch1
Control组	1.00 ± 0.00	1.00 ± 0.00	1.00 ± 0.00
si-NC组	1.01 ± 0.12	1.02 ± 0.11	1.02 ± 0.12
si-GNAS-AS1组	0.36 ± 0.04^*#	2.25 ± 0.24^*#	0.45 ± 0.05^*#
si-GNAS-AS1+inhibitor NC组	0.34 ± 0.04	2.23 ± 0.24	0.43 ± 0.04
si-GNAS-AS1+miR-449a inhibitor组	0.35 ± 0.04	1.62 ± 0.18^{&^}	0.86 ± 0.09^{&^}

组别	OD₄₉₀	克隆形成数（个）	划痕愈合率（%）	细胞侵袭数目（个）
Control组	0.70 ± 0.08	108.42 ± 7.30	42.66 ± 5.18	157.69 ± 8.48
si-NC组	0.68 ± 0.07	106.22 ± 6.47	43.45 ± 4.42	159.44 ± 10.08
si-GNAS-AS1组	0.29 ± 0.03^*#	52.69 ± 3.38^*#	17.69 ± 2.14^*#	93.21 ± 8.34^*#
si-GNAS-AS1+inhibitor NC组	0.27 ± 0.03	55.38 ± 5.02	18.32 ± 1.97	90.89 ± 10.25
si-GNAS-AS1+miR-449a inhibitor组	0.61 ± 0.06^{&^}	86.79 ± 7.08^{&^}	38.85 ± 3.56^{&^}	138.54 ± 11.55^{&^}

组别	Notch1	E-cadherin	Vimentin	N-cadherin
Control组	0.79 ± 0.08	0.28 ± 0.03	0.85 ± 0.09	0.87 ± 0.09
si-NC组	0.81 ± 0.08	0.26 ± 0.03	0.83 ± 0.08	0.89 ± 0.09
si-GNAS-AS1组	0.32 ± 0.03^*#	0.70 ± 0.07^*#	0.40 ± 0.04^*#	0.35 ± 0.03^*#
si-GNAS-AS1+inhibitor NC组	0.30 ± 0.03	0.72 ± 0.07	0.42 ± 0.04	0.33 ± 0.03
si-GNAS-AS1+miR-449a inhibitor组	0.68 ± 0.07^{&^}	0.42 ± 0.04^{&^}	0.75 ± 0.07^{&^}	0.76 ± 0.08^{&^}