收稿日期: 2024-09-06
网络出版日期: 2025-01-26
基金资助
吉林省科技厅项目(20210204186YY)
Screening of anti⁃fetal hemoglobin monoclonal antibodies based on trailing count method and its application in preliminary diagnostic method for β⁃thalassemia
Received date: 2024-09-06
Online published: 2025-01-26
目的 建立初步诊断β地中海贫血（BT）双抗体夹心ELISA方法。 方法 利用施孔数法筛选分泌抗胎儿血红蛋白（HbF）单抗的杂交瘤细胞株，采用ELISA、改良免疫细胞化学、Western blot方法进一步评价抗体的性质，采用戊二醛标记方法将碱性磷酸酶（ALP）和抗HbF单抗进行偶联，筛选最佳配对抗体用于双抗夹心ELISA方法，对40份临床血样进行检测。 结果 筛选到9株高亲和力分泌抗HbF单抗的杂交瘤细胞株，其中4株HbF单抗（3F7、4G1、6C1、9H7）与HbF特异性结合，与血红蛋白（HbA和HbA2）不发生交叉反应，抗体最高效价为1∶256 000，亲和力最高可达到2.36 × 108 L/mol。与高效液相色谱法比，以3F7作为捕获抗体与ALP-4G1配对建立的双抗夹心ELISA方法通过定量检测HbF含量以区分胎儿和健康人血样，其敏感度达80%。 结论 建立的夹心ELISA方法能够准确测量HbF水平，为临床上诊断BT提供帮助。
尹茉莉 , 徐婧哲 , 闫宇 , 童祯骁 , 刘磊 , 王会岩 . 基于施孔数法筛选抗胎儿血红蛋白单克隆抗体及其在初步诊断β地中海贫血方法中的应用[J]. 实用医学杂志, 2025 , 41(2) : 271 -277 . DOI: 10.3969/j.issn.1006-5725.2025.02.018
Objective To establish an initial diagnostic method for β-thalassemia （BT） using a double antibody sandwich ELISA approach. Methods The hybridoma producing monoclonal antibodies against anti-HbF were screened using a trailing count method. The mAbs were evaluated through ELISA， modified immunocytochemistry， and Western blot analysis. A double antibody-sandwich ELISA assay was established by labeling the pairs of mAbs with ALP using the glutaral method， and this detection system was used to analyze 40 serum samples. Results The results demonstrate the successful generation of nine hybridoma cell lines capable of secreting highly active anti-HbF monoclonal antibodies （mAbs）. Specifically， four mAbs （3F7， 4G1， 6C1， and 9H7） exhibited exclusive reactivity towards HbF without any cross-reactivity with hemoglobin variants （HbA and HbA2）. These four HbF-specific mAbs displayed exceptional specificity and sensitivity， with a maximum titer of 1∶256 000 and the highest affinity constant （Ka） recorded at 2.36×108 L/mol. Among these mAbs， optimal antibody pairing was achieved using capture antibody 3F7 in conjunction with ALP-4G1 for the development of a sandwich ELISA detection method. By employing this approach， fetal and healthy human blood samples were successfully quantified for HbF levels with an impressive detection sensitivity reaching up to 80%. Conclusion This sandwich ELISA demonstrated precise quantification of HbF levels， making it suiTab.for both research and diagnostic purposes in the field of β-thalassemia.
| 1 | CHEN S R， LIU Y Y， YIN X L， et al. Transfusion burden and willingness to pay for temporary alleviation of anemia status in transfusion-dependent beta-thalassemia patients in China［J］. BMC Health Serv Res， 2024， 24（1）： 1215. doi:10.1186/s12913-024-11547-2 |
| 2 | ZHUANG J L， WANG J Y， HUANG N， et al. Application of third-generation sequencing technology for identifying rare α- and β-globin gene variants in a Southeast Chinese region［J］. BMC Med Genomics， 2024， 17（1）： 241. doi:10.1186/s12920-024-02014-2 |
| 3 | CHEN W， BAN S， ZHU Z， et al. An Unexpected Detection of the Rare 48， XXYY in the Prenatal Diagnosis of a Fetus with β-Thalassemia Major［J］. Clin Lab， 2024， 70（10）：1-15. doi:10.7754/clin.lab.2024.240517 |
| 4 | SATTHAKARN S， PANYASAI K， PHASIT A， et al. Reliability of hemoglobin A2 value as measured by the Premier Resolution system for screening of β-thalassemia carriers［J］. Clin Chem Lab Med， 2023， 62（3）：453-463. doi:10.1515/cclm-2023-1006 |
| 5 | ASADALLAH S T， MOUSAVI K H， GHOLAMHOSSEIN T， et al. Inhibition of γ/β Globin Gene Switching in CD 34+ Derived Erythroid Cells by BCL11A RNA Silencing［J］. Indian J Hematol Blood Transfus， 2019， 35（4）：758-764. doi:10.1007/s12288-019-01131-8 |
| 6 | SAHEBKAR A， SEIFI F， MORADI-SARDAREH H， et al. The Shift of HbF to HbA under Influence of SKA2 Gene； A Possible Link between Cortisol and Hematopoietic Maturation in Term and Preterm Newborns［J］. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets， 2021， 21（3）：485-494. doi:10.2174/1871530320666200504091354 |
| 7 | 庄倩梅， 王耿， 王元白， 等. 联合检测HbA2和HbF对于筛查育龄人群地中海贫血突变携带者的价值［J］. 中华医学遗传学杂志， 2022， 39（1）：16-20. |
| 8 | ROBERTO G， CRISTINA Z， LUCIA C C， et al. The Long Scientific Journey of Sirolimus （Rapamycin）： From the Soil of Easter Island （Rapa Nui） to Applied Research and Clinical Trials on β-Thalassemia and Other Hemoglobinopathies［J］. Biology， 2023， 12（9）：1202-1217. doi:10.3390/biology12091202 |
| 9 | 裴世春， 何娜， 张立军，等. 应用 HTS-ELISA 筛选方法制备抗黄曲霉毒素 M1单抗［J］. 微生物学， 2010， 50（10）：1406-1411. |
| 10 | YIN M L， NIE Y W， LIU H， et al. Development of a europium nanoparticles lateral flow immunoassay for NGAL detection in urine and diagnosis of acute kidney injury［J］. BMC Nephrology， 2022， 23（1）：1-9. doi:10.1186/s12882-021-02493-w |
| 11 | 尹茉莉， 聂元旺， 刘浩， 等. 应用高效电融合技术制备小鼠抗人vasorin（VASN）单克隆抗体［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2021， 37（3）：265-270. |
| 12 | XIAO H， ZHU P， LIU B， et al. Generation and characterization of human delta-globin-specific monoclonal antibodies［J］. Blood Cell Mol Dis， 2010， 44（3）：127-132. doi:10.1016/j.bcmd.2009.11.003 |
| 13 | 甄玉萍， 裴世春， 高建伟. 基于HTS-ELISA的单克隆抗体分泌杂交瘤细胞筛选技术进展［J］. 食品安全质量检测学报， 2014， 7（5）：1960-1964. |
| 14 | KHALID N， SADIQ N K， AIMAL B， et al. Unraveling Impact of Hemoglobin F and A2 Levels： Correlation With Disease Severity and Treatment Response in Transfusion-Dependent Beta-Thalassemia［J］. Cureus， 2024， 16（1）：1-11. |
| 15 | 扬花梅， 孙菲， 马燕琳， 等. β-地中海贫血治疗的研究进展［J］. 实用医学杂志， 2021， 37（6）：816-820. |
| 16 | 谢小林， 刘家斌， 欧阳海红. 免疫细胞化学染色在胸腹水沉渣物检测中的应用［J］. 基层医学论坛， 2020， 24（14）：1936-1937. |
| 17 | 王继成， 姚翠泽， 黄演林， 等. 中国人3种最常见缺失型β地中海贫血的鉴别诊断［J］. 中国实验血液学杂志， 2021， 29（4）：1247-1250. |
| 18 | 曾惠华， 徐志邦. 血红蛋白电泳在地中海贫血筛查中的应用价值［J］. 中外医学研究， 2021， 19（13）：72-74. |
| 19 | 王展强， 杨华文， 黄基伟， 等. 比较两种血红蛋白A2测定方法对轻型α地中海贫血的诊断性能［J］. 实用医学杂志， 2022， 38（13）：1676-1679. |
| 20 | ZHANG F， ZHAN J Y， WANG Y， et al. Enhancing thalassemia gene carrier identification in non-anemic populations using artificial intelligence erythrocyte morphology analysis and machine learning［J］. Eur J Haematol， 2023， 112（5）：692-700. doi:10.1111/ejh.14160 |
| 21 | 李宗波.高分辨熔解曲线分析技术临床应用研究进展［J］. 临床医药实践， 2020， 29（2）：143-146. |
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