基于施孔数法筛选抗胎儿血红蛋白单克隆抗体及其在初步诊断β地中海贫血方法中的应用

doi:10.3969/j.issn.1006-5725.2025.02.018

摘要/Abstract

摘要：

目的建立初步诊断β地中海贫血（BT）双抗体夹心ELISA方法。方法利用施孔数法筛选分泌抗胎儿血红蛋白（HbF）单抗的杂交瘤细胞株，采用ELISA、改良免疫细胞化学、Western blot方法进一步评价抗体的性质，采用戊二醛标记方法将碱性磷酸酶（ALP）和抗HbF单抗进行偶联，筛选最佳配对抗体用于双抗夹心ELISA方法，对40份临床血样进行检测。结果筛选到9株高亲和力分泌抗HbF单抗的杂交瘤细胞株，其中4株HbF单抗（3F7、4G1、6C1、9H7）与HbF特异性结合，与血红蛋白（HbA和HbA₂）不发生交叉反应，抗体最高效价为1∶256 000，亲和力最高可达到2.36 × 10⁸ L/mol。与高效液相色谱法比，以3F7作为捕获抗体与ALP-4G1配对建立的双抗夹心ELISA方法通过定量检测HbF含量以区分胎儿和健康人血样，其敏感度达80%。结论建立的夹心ELISA方法能够准确测量HbF水平，为临床上诊断BT提供帮助。

关键词: 胎儿血红蛋白, 单克隆抗体, 定量检测, 施孔数法

Abstract:

Objective To establish an initial diagnostic method for β-thalassemia （BT） using a double antibody sandwich ELISA approach. Methods The hybridoma producing monoclonal antibodies against anti-HbF were screened using a trailing count method. The mAbs were evaluated through ELISA， modified immunocytochemistry， and Western blot analysis. A double antibody-sandwich ELISA assay was established by labeling the pairs of mAbs with ALP using the glutaral method， and this detection system was used to analyze 40 serum samples. Results The results demonstrate the successful generation of nine hybridoma cell lines capable of secreting highly active anti-HbF monoclonal antibodies （mAbs）. Specifically， four mAbs （3F7， 4G1， 6C1， and 9H7） exhibited exclusive reactivity towards HbF without any cross-reactivity with hemoglobin variants （HbA and HbA₂）. These four HbF-specific mAbs displayed exceptional specificity and sensitivity， with a maximum titer of 1∶256 000 and the highest affinity constant （Ka） recorded at 2.36×10⁸ L/mol. Among these mAbs， optimal antibody pairing was achieved using capture antibody 3F7 in conjunction with ALP-4G1 for the development of a sandwich ELISA detection method. By employing this approach， fetal and healthy human blood samples were successfully quantified for HbF levels with an impressive detection sensitivity reaching up to 80%. Conclusion This sandwich ELISA demonstrated precise quantification of HbF levels， making it suiTab.for both research and diagnostic purposes in the field of β-thalassemia.

Key words: fetal hemoglobin, monoclonal antibody, quantitative detection, trailing count method

中图分类号:

R392-33

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图/表 10

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参考文献 21

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单克隆抗体	待检样本 OD_450nm值	施孔数	阴性对照 OD_450nm值
1A5	0.35	3	0.02
2H3	0.62	3	0.03
3F7	0.43	4	0.04
4G1	0.36	5	0.01
6C1	0.33	3	0.05
9H7	0.42	5	0.03
10G8	0.55	2	0.03
16B5	0.53	2	0.04
21A9	0.46	3	0.01

单克隆抗体	胎儿脐带血红细胞	健康人红细胞
3F7	+	-
4G1	+	-
6C1	+	-
9H7	+	-
1A5	+	+
2H3	+	+
10G8	+	+
16B5	+	+
21A9	+	+

单克隆抗体	抗体效价	亲和常数/ （L/mol）	亚类	抗体浓度/（mg/mL）
3F7	1:256 000	2.36 × 10⁸	IgG1	5.08
4G1	1:128 000	8.58 × 10⁷	IgG2b	2.37
6C1	1:256 000	3.47 × 10⁷	IgG1	3.84
9H7	1:128 000	4.83 × 10⁷	IgG2a	7.65

单克隆抗体	OD_405nm
单克隆抗体	ALP-3F7	ALP-4G1	ALP-6C1	ALP-9H7
3F7	0.23	1.24	0.13	0.49
4G1	0.12	0.11	0.32	0.35
6C1	0.33	0.56	0.19	0.08
9H7	0.27	0.17	0.46	0.16