收稿日期: 2024-01-08
网络出版日期: 2024-06-14
基金资助
广东省重点领域研发计划项目(212020012620600005);广州市科技计划项目重点研发计划项目(202103000026)
Establishment and performance evaluation of subgenomic RNA detection methods for the 2019 novel coronavirus
Received date: 2024-01-08
Online published: 2024-06-14
目的 建立检测新型冠状病毒（新冠病毒）亚基因组RNA（subgenomic RNA， sgRNA）的方法，并对所建立的方法进行性能评估。 方法 根据新型冠状病毒sgRNA序列设计引物和探针，建立检测sgRNA的实时荧光逆转录PCR（reverse transcription polymerase chain reaction， RT-PCR）方法，对所建立的方法进行优化，包括引物、探针的浓度及比例、延伸温度、反应体积和模板量。并对所建立的方法进行性能评估，包括最低检测限、灵敏度、特异性和重复性。对临床样本进行新冠病毒sgRNA和基因组RNA（genomic RNA， gRNA）检测，并对检测结果进行分析。 结果 建立了检测新冠病毒sgRNA的RT-PCR方法。所建方法的最低检测限为100 copies/mL，对常见病原体的检测结果均为阴性。对高、中、低浓度样本sgRNA进行检测，CV均< 5%。115例疑似新冠病毒感染者的咽拭子样本sgRNA为阳性（115/330，阳性率为34.85%）。gRNA-N Ct值< 30时，sgRNA-N的阳性率为100.00%；gRNA-N的 Ct值介于30 ~ 32时，sgRNA-N的阳性率为68.75%；gRNA-N的 Ct值介于32 ~ 35时，sgRNA-N的阳性率为44.44%；gRNA-N的Ct值> 35时，sgRNA-N均为阴性。 结论 建立了新冠病毒sgRNA的RT-PCR检测方法，方法灵敏、特异、重复性好。
赵祉薇 , 陈茶 , 黄彬 . 新型冠状病毒亚基因组RNA检测方法的建立及性能评估[J]. 实用医学杂志, 2024 , 40(12) : 1737 -1743 . DOI: 10.3969/j.issn.1006-5725.2024.12.021
Objective To establish a method for detecting the 2019 novel coronavirus subgenomic RNA （sgRNA）， and evaluate the performance of the established method. Methods Primers and probes were designed according to the subgenomic sequence of the 2019 novel coronavirus， and a reverse transcription PCR method for sgRNA detection was established. The established method was optimized， including the concentration and proportion of primers and probes， extension temperature， reaction volume and template amount. The performance of the method was evaluated， including the limit of detection， sensitivity， specificity and repeatability. sgRNA and genomic RNA （gRNA） were detected in clinical samples， and the results were analyzed. Results In this study， an RT-PCR method for the detection of sgRNA of the 2019 novel coronavirus was established. The limit of detection of this method was 100 copies/mL， and the detection results of common pathogens were negative. The CV of sgRNA in high， medium and low concentration samples were less than 5%. sgRNA was positive in 115 suspected 2019 novel coronavirus infected patients （115/330， 34.85%）. When the Ct value of gRNA-N was less than 30， the positive rate of sgRNA was 100.00%. When the Ct value of gRNA-N was in the range of 30-32， the positive rate of sgRNA was 68.75%. When the Ct value of gRNA-N was in the range of 32-35， the positive rate of sgRNA was 44.44%. When the Ct value of gRNA-N was greater than 35， the sgRNA was negative. Conclusion The RT-PCR method for the detection of sgRNA of the 2019 novel coronavirus was established， and the detection method was sensitive， specific and reproducible.
| 1 | MARKOV P V， GHAFARI M， BEER M， et al. The evolution of SARS-CoV-2 ［J］. Nat Rev Microbiol， 2023， 21（6）： 361-379. doi:10.1038/s41579-023-00878-2 |
| 2 | ZHOU P， YANG X L， WANG X G， et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin ［J］. Nature， 2020， 579（7798）： 270-273. doi:10.1038/s41586-020-2012-7 |
| 3 | BRANTL S. Regulatory mechanisms employed by cis-encoded antisense RNAs. ［J］. Curr Opin Microbiol， 2007， 10（2）： 102-109. doi:10.1016/j.mib.2007.03.012 |
| 4 | CHEN N， ZHOU M， DONG X， et al. Epidemiological and clinical characteristics of 99 cases of 2019 novel coronavirus pneumonia in Wuhan， China： a descriptive study ［J］. Lancet， 2020， 395（10223）： 507-513. doi:10.1016/s0140-6736(20)30211-7 |
| 5 | CARABELLI A M， PEACOCK T P， THORNE L G， et al. SARS-CoV-2 variant biology： immune escape， transmission and fitness ［J］. Nat Rev Microbiol， 2023， 21（3）： 162-177. |
| 6 | YüCE M， FILIZTEKIN E， ?ZKAYA K G. COVID-19 diagnosis -A review of current methods ［J］. Biosens Bioelectron， 2021， 172： 112752. doi:10.1016/j.bios.2020.112752 |
| 7 | 许玉玲， 王海霞， 李金月， 等. 新型冠状病毒抗原检测胶体金法与核酸检测实时荧光RT-PCR方法比较 ［J］. 实用医学杂志， 2022， 38（7）： 791-794. doi:10.3969/j.issn.1006-5725.2022.07.003 |
| 8 | KWAN L Y， JOO K O， RYOUN K H， et al. Clinical and epidemiologic characteristics of inconclusive results in SARS-CoV-2 RT-PCR assays ［J］. BMC Infect Dis， 2021， 21（1）：851. doi:10.1186/s12879-021-06534-5 |
| 9 | W?LFEL R， CORMAN V M， GUGGEMOS W， et al. Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019 ［J］. Nature， 2020， 581（7809）： 465-469. doi:10.1038/s41586-020-2196-x |
| 10 | WANG D， JIANG A， FENG J， et al. The SARS-CoV-2 subgenome landscape and its novel regulatory features ［J］. Mol Cell， 2021， 81（10）： 2135-2147. e5. doi:10.1016/j.molcel.2021.02.036 |
| 11 | BRANT A C， TIAN W， MAJERCIAK V， et al. SARS-CoV-2： from its discovery to genome structure， transcription， and replication ［J］. Cell Biosci， 2021， 11（1）： 136. doi:10.1186/s13578-021-00643-z |
| 12 | CHANG J J Y， RAWLINSON D， PITT M E， et al. Transcriptional and epi-transcriptional dynamics of SARS-CoV-2 during cellular infection ［J］. Cell Rep， 2021，35（6）：10910. doi:10.1016/j.celrep.2021.109108 |
| 13 | WANG M， FU A， HU B， et al. Nanopore Targeted Sequencing for the Accurate and Comprehensive Detection of SARS-CoV-2 and Other Respiratory Viruses ［J］. Small， 2021， 17（32）： e2104078. doi:10.1002/smll.202104078 |
| 14 | NOMBURG J， MEYERSON M， DECAPRIO J A. Pervasive generation of non-canonical subgenomic RNAs by SARS-CoV-2 ［J］. Genome Med， 2020， 12（1）： 108. doi:10.1186/s13073-020-00802-w |
| 15 | ZIV O， PRICE J， SHALAMOVA L， et al. The Short- and Long-Range RNA-RNA Interactome of SARS-CoV-2 ［J］. Mol Cell， 2020， 80（6）： 1067-1077. doi:10.1016/j.molcel.2020.11.004 |
| 16 | FORD L， LEE C， PRAY I W， et al. Epidemiologic Characteristics Associated With Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 （SARS-CoV-2） Antigen-Based Test Results， Real-Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction （rRT-PCR） Cycle Threshold Values， Subgenomic RNA， and Viral Culture Results From University Testing ［J］. Clin Infect Dis， 2021， 73（6）： e1348-e1355. doi:10.1093/cid/ciab303 |
| 17 | KIM J Y， BAE J Y， BAE S， et al. Diagnostic usefulness of subgenomic RNA detection of viable SARS-CoV-2 in patients with COVID-19 ［J］. Clin Microbiol Infect， 2022， 28（1）： 101-106. doi:10.1016/j.cmi.2021.08.009 |
| 18 | THORNE L G， BOUHADDOU M， A-K REUSCHL， et al. Evolution of enhanced innate immune evasion by SARS-CoV-2 ［J］. Nature， 2022， 602（7897）： 487-495. doi:10.1038/s41586-021-04352-y |
| 19 | CARROLL T， FOX D， VAN DOREMALEN N， et al. The B.1.427/1.429 （epsilon） SARS-CoV-2 variants are more virulent than ancestral B.1 （614G） in Syrian hamsters ［J］. PLoS Pathog， 2022， 18（2）：e1009914. doi:10.1371/journal.ppat.1009914 |
| 20 | TELWATTE S， MARTIN H A， MARCZAK R， et al. Novel RT-ddPCR assays for measuring the levels of subgenomic and genomic SARS-CoV-2 transcripts ［J］. Methods， 2022， 201： 15-25. doi:10.1016/j.ymeth.2021.04.011 |
| 21 | WANG D， HU B， HU C， et al. Clinical Characteristics of 138 Hospitalized Patients With 2019 Novel Coronavirus-Infected Pneumonia in Wuhan， China ［J］. JAMA， 2020， 323（11）： 1061-1069. doi:10.1001/jama.2020.1585 |
| 22 | SHRESTHA L B， FOSTER C， RAWLINSON W， et al. Evolution of the SARS-CoV-2 omicron variants BA.1 to BA.5： Implications for immune escape and transmission ［J］. Rev Med Virol， 2022， 32（5）： e2381. doi:10.1002/rmv.2381 |
| 23 | UGOLINI C， MULRONEY L， LEGER A， et al. Nanopore ReCappable sequencing maps SARS-CoV-2 5' capping sites and provides new insights into the structure of sgRNAs ［J］. Nucleic Acids Res， 2022， 50（6）： 3475-3489. doi:10.1093/nar/gkac144 |
| 24 | KIM D， LEE J Y， YANG J S， et al. The Architecture of SARS-CoV-2 Transcriptome ［J］. Cell， 2020， 181（4）：914-921.e10. doi:10.1016/j.cell.2020.04.011 |
| 25 | TELWATTE S， KUMAR N， VALLEJO-GRACIA A， et al. Novel RT-ddPCR assays for simultaneous quantification of multiple noncoding and coding regions of SARS-CoV-2 RNA ［J］. J Virol Methods， 2021， 292： 114115. doi:10.1016/j.jviromet.2021.114115 |
| 26 | 乔乔， 吴涛， 朱小娟， 等. 新型冠状病毒亚基因组RNA荧光重组酶介导等温扩增检测方法的建立及评价 ［J］. 中国病毒病杂志， 2022， 12（6）： 444-447. |
| 27 | UGOLINI C， MULRONEY L， LEGER A， et al. Nanopore ReCappable sequencing maps SARS-CoV-2 5' capping sites and provides new insights into the structure of sgRNAs ［J］. Nucleic Acids Res， 2022， 50（6）： 3475-3489. doi:10.1093/nar/gkac144 |
| 28 | DAGOTTO G， MERCADO N B， MARTINEZ D R， et al. Comparison of Subgenomic and Total RNA in SARS-CoV-2 Challenged Rhesus Macaques ［J］. J Virol， 2021， 95（8）：e02370-20. doi:10.1128/jvi.02370-20 |
| 29 | ZHANG C， CUI H， GUO Z， et al. SARS-CoV-2 Virus Culture， Genomic and Subgenomic RNA Load， and Rapid Antigen Test in Experimentally Infected Syrian Hamsters ［J］. J Virol， 2022， 96（18）： e0103422. doi:10.1128/jvi.01034-22 |
| 30 | BRAVO M S， BERENGUA C， MARíN P， et al. Viral Culture Confirmed SARS-CoV-2 Subgenomic RNA Value as a Good Surrogate Marker of Infectivity ［J］. J Clin Microbiol， 2022， 60（1）：e0160921. doi:10.1128/jcm.01609-21 |
| 31 | THORNE L G， BOUHADDOU M， REUSCHL A K， et al. Evolution of enhanced innate immune evasion by SARS-CoV-2 ［J］. Nature， 2022， 602（7897）： 487-495. doi:10.1038/s41586-021-04352-y |
| 32 | AVANZATO V A， MATSON M J， SEIFERT S N， et al. Case Study： Prolonged Infectious SARS-CoV-2 Shedding from an Asymptomatic Immunocompromised Individual with Cancer ［J］. Cell， 2020， 183（7）： 1901-1912.e9. doi:10.1016/j.cell.2020.10.049 |
| 33 | 栾涛，杨罡，王帅颖，等. “长新冠”综合征研究最新进展［J］. 实用医学杂志， 2023，39（10）：1195-1200. |
| 34 | 李娜，白彝华，蒋红樱，等. 长期维持性透析患者的衰弱现况及其影响因素［J］. 实用医学杂志， 2024，40（3）：330-335. |
/
| 〈 |
|
〉 |