肿节风总黄酮影响骨髓间充质干细胞及其外泌体促进巨核细胞分化的作用及机制

doi:10.3969/j.issn.1006-5725.2025.11.003

摘要/Abstract

摘要：

目的探索肿节风总黄酮（TFFSG）影响免疫性血小板减少症（ITP）状态骨髓间充质干细胞（BMSCs）及其外泌体（BMSCs-Exos）促进巨核细胞分化成熟的效应及机制。方法 SD大鼠BMSCs为研究对象，分为空白对照组、ITP-BMSCs模型组、肿节风总黄酮低（1.95 μg/mL）、中（3.90 μg/mL）、高（7.80 μg/mL）剂量干预组。分别检测各组BMSCs细胞凋亡率及相关蛋白，B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白（BAX）和胱天蛋白酶-3（Caspase-3）的表达情况。提取空白对照组外泌体（NC-BMSCs-Exos）、ITP-BMSCs模型组外泌体（APS-BMSCs-Exos），肿节风总黄酮中剂量组的外泌体（TFFSG-BMSCs-Exos），各组外泌体5 μg/mL与巨核系Dami细胞共培养96 h，流式细胞术检测各组细胞巨核系分化标志分子（CD41a、CD42b、CD61）表达和多倍体细胞（≥ 4 N）比例，Western Blot检测各组细胞p-MEK1/2、MEK1/2和p-ERK1/2、ERK1/2的表达。结果与ITP-BMSCs模型组相比，肿节风总黄酮低、中、高3个剂量组BMSCs凋亡率均显著下降（P < 0.01），肿节风总黄酮的中、高剂量组BAX和Caspase-3的表达显著下调，而Bcl-2的表达则显著上调（P < 0.05，P < 0.01）。与ITP-BMSCs-Exos组比较，TFFSG-BMSCs-Exos组的Dami细胞巨核系分化标志分子CD41a⁺、CD42b⁺、CD61⁺和多倍体细胞（≥ 4 N）比例显著增加（P < 0.05），p-MEK1/2/MEK1/2和p-ERK1/2/ERK1/2表达明显上调（P < 0.05）。结论肿节风总黄酮能抑制体外ITP状态BMSCs凋亡，同时可以通过BMSCs-Exos上调MEK1/2/ERK1/2信号通路促进巨核细胞分化和多倍体化成熟。

关键词: 免疫性血小板减少症, 骨髓间充质干细胞, 外泌体, 肿节风总黄酮

Abstract:

Objective To investigate the effects and underlying mechanisms of total flavonoids of sarcandra glabra （TFFSG） on bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） and their derived exosomes in immune thrombocytopenia （ITP）， with a focus on promoting megakaryocyte differentiation and maturation. Methods BMSCs induced by rabbit anti?rat platelet serum （APS） were divided into five groups： a blank control group， an ITP?BMSCs model group， and three TFFSG intervention groups with low （1.95 μg/mL）， medium （3.90 μg/mL）， and high doses （7.80 μg/mL）. The apoptosis rates and the expression levels of apoptosis?related proteins?B?cell lymphoma 2 （Bcl?2）， Bcl?2?associated X protein （BAX）， and Cysteinyl aspartate?specific proteinase?3 （Caspase?3）?were assessed. Exosomes were isolated from the blank control group （NC?BMSCs?Exos）， the ITP?BMSCs model group （ITP?BMSCs?Exos）， and the medium?dose TFFSG group （TFFSG?BMSCs?Exos）. Each group's exosomes （5 μg/mL） were co?cultured with megakaryocytic lineage Dami cells for 96 hours. Flow cytometry was employed to evaluate the expression of megakaryocytic differentiation markers （CD41a， CD42b， CD61） and the proportion of polyploid cells （≥ 4 N） in each group. Western Blot analysis was conducted to examine the expression of p?MEK1/2， MEK1/2， p?ERK1/2， and ERK1/2 across all groups. Results Compared with the ITP?BMSCs model group， the apoptosis rates in all TFFSG intervention groups were significantly reduced （P < 0.01）. In the medium? and high?dose TFFSG groups， BAX and Caspase?3 expression levels were markedly downregulated， whereas Bcl?2 expression was upregulated （P < 0.05， P < 0.01）. Compared with the ITP?BMSCs?Exos group， the TFFSG?BMSCs?Exos group demonstrated increased expression of CD41a⁺， CD42b⁺， and CD61⁺， a higher proportion of polyploid cells （≥ 4 N）（P < 0.05）， as well as elevated ratios of p?MEK1/2 to MEK1/2 and p?ERK1/2 to ERK1/2（P < 0.05）. Conclusion TFFSG inhibits apoptosis of ITP?state BMSCs in vitro and promotes megakaryocyte differentiation and polyploidization maturation through BMSC?derived exosomes by activating the MEK1/2?ERK1/2 signaling pathway.

Key words: immune thrombocytopenia, bone marrow mesenchymal stem cells, exosomes, total flavonoids of Sarcandra glabra

中图分类号:

285.5

刘慧珍,卢晓南,柳歌,蔡关庆,李平安,曾英坚,尚广彬. 肿节风总黄酮影响骨髓间充质干细胞及其外泌体促进巨核细胞分化的作用及机制[J]. 实用医学杂志, 2025, 41(11): 1618-1626.

Huizhen LIU,Xiaonan LU,Ge LIU,Guanqing CAI,Pingan LI,Yingjian ZENG,Guangbin SHANG. The effects and mechanism of total flavonoids of Sarcandra glabra in modulating bone marrow mesenchymal stem cells and their exosomes to promote megakaryocyte differentiation[J]. The Journal of Practical Medicine, 2025, 41(11): 1618-1626.

图/表 12

图1

表1

图2

表2

表3

图3

图4

图5

表4

表5

图6

表6

参考文献 27

1	GONCALVES I， LEWIS C， GRAINGER B， et al. Thrombosis in patients with immune thrombocytopenia： incidence， risk， and clinical outcomes［J］. Res Pract Thromb Haemost， 2024，8（1）： 102342. doi:10.1016/j.rpth.2024.102342 doi: 10.1016/j.rpth.2024.102342
2	王蕾，贺小宁，李正翔，等. 原发免疫性血小板减少症患者真实世界治疗现状与疾病负担研究［J］. 中国医院药学杂志， 2023，43（14）： 1602-1607. doi:10.13286/j.1001-5213.2023.14.13 doi: 10.13286/j.1001-5213.2023.14.13
3	GOETTE N P， BORZONE F R， DISCIANNI L A， et al. Megakaryocyte-stromal cell interactions： Effect on megakaryocyte proliferation， proplatelet production， and survival［J］. Exp Hematol， 2022，107： 24-37. doi:10.1016/j.exphem.2022.01.002 doi: 10.1016/j.exphem.2022.01.002
4	WANG M， FENG R， ZHANG J M， et al. Dysregulated megakaryocyte distribution associated with nestin（+） mesenchymal stem cells in immune thrombocytopenia［J］. Blood Adv， 2019，3（9）： 1416-1428. doi:10.1182/bloodadvances.2018026690 doi: 10.1182/bloodadvances.2018026690
5	何月，纪德香，卢玮，等. 免疫性血小板减少症患者骨髓间充质干细胞自身功能缺陷机制的研究进展［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2022，38（3）： 275-280.
6	WU F， SHE Z， LI C， et al. Therapeutic potential of MSCs and MSC-derived extracellular vesicles in immune thrombocytopenia［J］. Stem Cell Res Ther， 2023，14（1）： 79. doi:10.1186/s13287-023-03323-6 doi: 10.1186/s13287-023-03323-6
7	CHEN Y， XU Y， CHI Y， et al. Efficacy and safety of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in the treatment of refractory immune thrombocytopenia： A prospective， single arm， phase I trial［J］. Signal Transduct Target Ther， 2024，9（1）： 102. doi:10.1038/s41392-024-01793-5 doi: 10.1038/s41392-024-01793-5
8	师锦宁. 血康口服液治疗血小板减少症临床疗效观察［J］. 中国现代药物应用， 2009，3（22）： 110-111. doi:10.3969/j.issn.1673-9523.2009.22.096 doi: 10.3969/j.issn.1673-9523.2009.22.096
9	卢晓南，彭文虎，徐国良，等. 肿节风总黄酮对免疫性血小板减少大鼠骨髓细胞微环境的影响［J］. 中药药理与临床， 2015，31（6）： 66-69.
10	卢晓南，孙慧娟，朱静，等. 肿节风总黄酮对细胞共培养体系中巨核细胞分化、成熟的影响［J］. 中药新药与临床药理， 2019，30（11）： 1277-1283.
11	巢素珍，周年，石心怡，等. 芒果苷对同型半胱氨酸诱导骨髓间充质干细胞分化的影响［J］. 实用医学杂志， 2024，40（23）： 3284-3290. doi:10.3969/j.issn.1006-5725.2024.23.002 doi: 10.3969/j.issn.1006-5725.2024.23.002
12	蒋焰，王小勤，梅鸿，等. Ⅱ型肺泡上皮细胞来源外泌体miR-21-5p靶向SKP2缓解支气管肺发育不良［J］. 实用医学杂志， 2024，40（23）： 3298-3305. doi:10.3969/j.issn.1006-5725.2024.23.004 doi: 10.3969/j.issn.1006-5725.2024.23.004
13	ZHANG Z， SHANG G， LU Z， et al. Daucosterol regulates JAK2-STAT3 signaling pathway to promote megakaryocyte differentiation［J］. Blood Cells Mol Dis， 2024，107： 102858. doi:10.1016/j.bcmd.2024.102858 doi: 10.1016/j.bcmd.2024.102858
14	MITITELU A， ONISAI M C， ROSCA A， et al. Current Understanding of Immune Thrombocytopenia： A Review of Pathogenesis and Treatment Options［J］. Int J Mol Sci， 2024，25（4）：2163. doi:10.3390/ijms25042163 doi: 10.3390/ijms25042163
15	ZHANG J M， ZHU X L， XUE J， et al. Integrated mRNA and miRNA profiling revealed deregulation of cellular stress response in bone marrow mesenchymal stem cells derived from patients with immune thrombocytopenia［J］. Funct Integr Genomics， 2018，18（3）： 287-299. doi:10.1007/s10142-018-0591-2 doi: 10.1007/s10142-018-0591-2
16	郑颖，黄珂敏. 外泌体研究态势和前瞻的计量与可视化分析［J］. 中国组织工程研究， 2024，28（13）： 2126-2132.
17	HE Y， JI D， LU W， et al. Bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes induce the Th17/Treg imbalance in immune thrombocytopenia through miR-146a-5p/IRAK1 axis［J］. Hum Cell， 2021，34（5）： 1360-1374. doi:10.1007/s13577-021-00547-7 doi: 10.1007/s13577-021-00547-7
18	鲍静，许晗，汪万杰，等. miR-141-5p/ZNF705A对慢性粒细胞白血病细胞源外泌体调控骨髓间充质干细胞黏附作用的机制［J］. 中国药理学通报， 2024，40（3）： 506-514.
19	ALDOGHACHI A F， LOH J K， WANG M L， et al. Current developments and therapeutic potentials of exosomes from induced pluripotent stem cells-derived mesenchymal stem cells［J］. J Chin Med Assoc， 2023，86（4）： 356-365. doi:10.1097/jcma.0000000000000899 doi: 10.1097/jcma.0000000000000899
20	王双敏，汪显耀，何志旭. 工程化间充质干细胞来源外泌体在靶向递送抗肿瘤药物中的应用与问题［J］. 中国组织工程研究， 2025，29（23）： 4975-4983. doi:10.12307/2025.092 doi: 10.12307/2025.092
21	杨英，饶春明. 干细胞产品质量控制分析方法研究进展［J］. 药物分析杂志， 2025，45（1）： 4-11.
22	WU D， ZHAO X， XIE J， et al. Physical modulation of mesenchymal stem cell exosomes： A new perspective for regenerative medicine［J］. Cell Prolif， 2024，57（8）： e13630. doi:10.1111/cpr.13630 doi: 10.1111/cpr.13630
23	周洋，刘可鑫，王得利，等. 工程化细胞外囊泡修复骨缺损的再生作用［J］. 中国组织工程研究， 2025，29（36）： 7839-7847.
24	WANG H， HE J， XU C， et al. Decoding Human Megakaryocyte Development［J］. Cell Stem Cell， 2021，28（3）： 535-549. doi:10.1016/j.stem.2020.11.006 doi: 10.1016/j.stem.2020.11.006
25	BEURET L， FORTIER-BEAULIEU S P， RONDEAU V， et al. Mek1 and Mek2 Functional Redundancy in Erythropoiesis［J］. Front Cell Dev Biol， 2021，9： 639022. doi:10.3389/fcell.2021.639022 doi: 10.3389/fcell.2021.639022
26	MAZHARIAN A， WATSON S P， SEVERIN S. Critical role for ERK1/2 in bone marrow and fetal liver-derived primary megakaryocyte differentiation， motility， and proplatelet formation［J］. Exp Hematol， 2009，37（10）： 1238-1249. doi:10.1016/j.exphem.2009.07.006 doi: 10.1016/j.exphem.2009.07.006
27	LI Y， LAI J， RAN M， et al. Alnustone promotes megakaryocyte differentiation and platelet production via the interleukin-17A/interleukin-17A receptor/Src/RAC1/MEK/ERK signaling pathway［J］. Eur J Pharmacol， 2024，971： 176548. doi:10.1016/j.ejphar.2024.176548 doi: 10.1016/j.ejphar.2024.176548

组别	24 h	48 h（%）	72 h	96 h
control组	100.00 ± 0.00	100.00 ± 0.00	100.00 ± 0.00	100.00 ± 0.00
0.975 μg/mL组	95.79 ± 4.31^?	98.87 ± 3.96	104.4 ± 4.28	95.97 ± 4.07
1.95 μg/mL组	97.29 ± 4.00	101.5 ± 4.20	108.9 ± 4.24^??	103.8 ± 3.77
3.9 μg/mL组	96.89 ± 2.88	98.24 ± 4.15	109.1 ± 4.79^??	102.8 ± 4.03
7.8 μg/mL组	94.05 ± 2.72^??	94.68 ± 3.28^??	108.0 ± 5.66^??	106.2 ± 5.98^?
15.6 μg/mL组	89.44 ± 2.73^???	83.75 ± 3.95^???	91.86 ± 2.89^??	76.23 ± 3.10^???
F值	7.988	19.79	16.54	39.13
P值	0.0001	< 0.0001	< 0.0001	< 0.0001

组别	剂量/（μg/mL）	早期凋亡率/%	晚期凋亡率/%	总凋亡率/%
正常对照组	-	5.71 ± 0.52	4.70 ± 0.16	10.55 ± 0.71
ITP-BMSCs模型组	-	31.88 ± 4.99^**	16.13 ± 1.60^**	45.23 ± 0.70^**
TFFSG低剂量组	1.95	13.43 ± 3.01^##	17.33 ± 1.97	30.77 ± 2.32^##
TFFSG中剂量组	3.90	14.93 ± 0.47^##	8.20 ± 0.92^##	23.14 ± 0.65^##
TFFSG高剂量组	7.80	8.61 ± 0.78^##	8.44 ± 0.18^##	17.05 ± 0.61^##
F值		43.74	61.39	375.0
P值		< 0.0001	< 0.0001	< 0.0001

组别	BAX	Bcl-2	Caspase-3
正常对照组	1 ± 0	1 ± 0	1 ± 0
ITP-BMSCs模型组	2.34 ± 0.53	0.36 ± 0.14^?	1.38 ± 0.04^?
TFFSG低剂量组	1.74 ± 0.35	0.52 ± 0.06	1.03 ± 0.08
TFFSG中剂量组	1.43 ± 0.22^#	0.70 ± 0.13	0.80 ± 0.20^#
TFFSG高剂量组	1.25 ± 0.31^#	1.06 ± 0.30^##	0.70 ± 0.23^#
F值	4.837	6.926	6.580
P值	0.057 1	0.028 5	0.031 6

组别	CD41a	CD42b	CD61
NC-BMSCs-Exos组	6.85 ± 0.40	20.47 ± 2.05	22.20 ± 1.71
APS-BMSCs-Exos组	4.00 ± 0.70	9.29 ± 0.07^?	2.51 ± 0.22^?
TFFSG-BMSCs-Exos组	11.47 ± 2.20^#?	26.93 ± 0.81^#?	27.07 ± 0.65^#?
TFFSG-BMSCs-Exos+抑制剂组	0.58 ± 0.14^&	7.62 ± 0.48^&	0.27 ± 0.21^&
F值	46.44	199.6	645.6
P值	< 0.000 1	< 0.000 1	< 0.000 1

组别	2N	≥4N
NC-BMSCs-Exos组	54.57 ± 1.00	39.63 ± 0.51
APS-BMSCs-Exos组	63.10 ± 4.02^?	28.13 ± 1.10^?
TFFSG-BMSCs-Exos组	46.13 ± 0.12^#?	50.40 ± 1.14^#?
TFFSG-BMSCs-Exos+抑制剂组	57.33 ± 2.21^&	20.87 ± 1.69^&
F值	27.13	360.3
P值	0.000 2	< 0.000 1