屋尘螨诱导的自噬通过β-catenin-Snail信号通路影响气道上皮屏障功能

doi:10.3969/j.issn.1006-5725.2025.09.006

摘要/Abstract

摘要：

目的探讨屋尘螨（house dust mites， HDM）诱导的细胞自噬通过β-catenin-Snail信号途径影响气道上皮紧密连接的机制。方法使用不同时间点（0、3、6、12、24、48 h）和不同浓度的HDM（0、40、100、200 μg/mL）刺激人支气管上皮细胞（16HBE），筛选合适的刺激浓度和刺激时间。使用氧化应激抑制剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）、细胞自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）、HDM以及它们联合刺激16HBE细胞。使用mCherry-EGFP-LC3B、Beclin-1-siRNA、ATG14-siRNA慢病毒转染细胞，然后用NAC和HDM刺激细胞。免疫荧光检测气道上皮细胞中自噬相关蛋白LC3B和紧密连接相关蛋白Occludin、ZO-1的表达水平；采用DCFH-DA检测各组细胞中活性氧（ROS）水平；Western blot检测Occludin、ZO-1、LC3B、Beclin-1、ATG5、ATG14、P62、Snail、β-catenin、p-β-catenin蛋白表达水平。结果免疫荧光结果显示，与对照组比较，200 μg/mL HDM刺激可以显著诱导细胞自噬（P < 0.05），增加LC3B蛋白表达水平（P < 0.05），同时促进ROS水平（P < 0.05）；与HDM组相比，HDM + 3-MA组、HDM + ATG14-si组和HDM + Beclin-1-si组的紧密连接相关蛋白Occludin、ZO-1的表达水平明显增高（P < 0.05），HDM + NAC组ROS水平明显下降，且LC3B蛋白表达水平明显降低。Western blot实验结果显示，与HDM组相比，3-MA和自噬蛋白低表达珠（Beclin-1-si、ATG14-si）可以减轻HDM诱导的细胞自噬（P < 0.05），同时抑制HDM诱导的Snail、p-β-catenin表达上调，改善HDM诱导的Occludin、ZO-1降低（P < 0.05）；与HDM组相比，NAC+HDM组LC3BⅠ向LC3BⅡ的转化减少（P < 0.001），Snail、p-β-catenin、Beclin-1、ATG14蛋白水平明显降低（P < 0.01），而Occludin、ZO-1蛋白水平明显升高（P < 0.05）。结论 HDM通过引起细胞自噬影响气道上皮细胞间的紧密连接，其机制可能与β-catenin-Snail信号通路有关。

关键词: 屋尘螨, 细胞自噬, 气道上皮细胞, 紧密连接

Abstract:

Objective To investigate the mechanism of autophagy induced by House dust mites （HDM） on airway epithelial tight junction through β-catenin-Snail signaling pathway. Methods Human bronchial epithelial cells （16HBE） were stimulated with HDM at different time points （0， 3， 6， 12， 24， 48 h） and different concentrations （0， 40， 100， 200 μg/mL） to screen the appropriate stimulation concentration and stimulation time. 16HBE cells were treated with oxidative stress inhibitor N-acetylcysteine （NAC）， autophagy inhibitor 3-methyladenine （3-MA）， HDM， and their combinations. Cells were transfected with mCherry-EGFP-LC3B， Beclin-1-siRNA， and ATG14-siRNA lentivirus and then stimulated with NAC and HDM. Immunofluorescence was used to detect the expression levels of autophagy-related protein LC3B， tight junction-related proteins Occludin， and ZO-1 in airway epithelial cells. The level of reactive oxygen species （ROS） was detected by using DCFH-DA in each group. The protein expression levels of Occludin， ZO-1， LC3B， Beclin-1， ATG5， ATG14， P62， Snail， β-catenin and p-β-catenin were detected by Western blot method. Results Immunofluorescence results showed that compared with the control group， 200 μg/mL HDM stimulation induced cellular autophagy， increased the expression level of LC3B protein， and promoted the level of ROS， all with statistical significances（all P < 0.05）. Compared with the HDM group， the HDM + 3-MA， HDM + ATG14-si， and HDM + Beclin-1-si groupsall showed significantincreases in the expression levels of tight junction-related proteins Occludin and ZO-1 （P < 0.05）. The HDM + NAC group demonstrated significant decreases both in the level of ROS andin the expression level of LC3B protein.Western blot results revealed that compared with HDM， 3-MA and autophagy protein low-expression beads （Beclin-1-si， ATG14-si） attenuated HDM-induced cellular autophagy （P < 0.05）， inhibited HDM-induced upregulation of Snail and p-β- catenin expression， and improved HDM-induced decreases in Occludin and ZO-1（P < 0.05）. Moreover， compared with the HDM group， the NAC + HDM group exhibited significant decreases both in the conversion of LC3BⅠ to LC3BⅡ （P < 0.001） in the protein levels of Snail， p-β-catenin， Beclin-1 and ATG14 （P < 0.01）， but significant increases in the protein levels of Occludin and ZO-1 （P < 0.05）. Conclusion HDM affects the tight connections between airway epithelial cells by inducing autophagy， which may be attributed to the β-catenin-Snail signaling pathway.

Key words: house dust mite, cellular autophagy, human bronchial epithelial cells, tight junctions

中图分类号:

R563

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